崔曉霞，趙 碩，郭書巧，束紅梅，何曉蘭，倪萬潮，鞏元勇，劉來華

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟作物研究所，江蘇 南京 210014；2.教育部植物與土壤互作重點實驗室， 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源、環(huán)境及糧食安全中心，北京 100193)

植物谷氨酸受體(Glutamate receptors-like receptors，GLRs)最早是Lam等[1]于1998年在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的，通過序列的同源性分析獲得20個與動物離子型谷氨酸受體(Ionotropic glutamate receptors, iGLuRs)同源的基因，命名為AtGLRs。隨后在多個不同植物中有關(guān)于谷氨酸受體基因家族的報道。在水稻基因組中都發(fā)現(xiàn)有同擬南芥谷氨酸受體高度同源的24個OsGLRs基因[2]，Aouini等[3]鑒定出番茄基因組中包含13個SlGLRs基因，蘋果基因組中鑒定出32個MdGLRs基因[4]。

目前，已有多個植物GLRs基因的分子生理功能獲得解析，作為模式植物擬南芥的AtGLRs基因研究的相對較多[5]，其他植物也有報道。根部的AtGLR3.2和AtGLR3.4主要在韌皮部表達，AtGLR3.2和AtGLR3.4缺失突變體表現(xiàn)出有大量側(cè)根原基出現(xiàn)，推測和這2個基因相關(guān)的離子通道可能通過韌皮部的Ca2+信號調(diào)控側(cè)根的生長[6]。Kang等[7]研究表明，AtGLR1.1參與擬南芥的ABA生物合成和C/N代謝以此調(diào)控種子的萌發(fā)，AtGLR1.1還參與了擬南芥的水分調(diào)節(jié)[8]。Zheng等[9]研究證實，AtGLR1.2和AtGLR1.3通過調(diào)控茉莉酸信號途徑增強擬南芥的耐寒性。Kong等[10]的研究結(jié)果表明，在種子萌發(fā)過程中AtGLR3.5上調(diào)表達促進胞質(zhì)Ca2+濃度的增加，從而抑制ABI4的表達，達到促進種子萌發(fā)的作用。Cho等[11]發(fā)現(xiàn)AtGLR3.1在葉片的保衛(wèi)細胞中表達，超表達AtGLR3.1基因?qū)⒂绊懕Ｐl(wèi)細胞對Ca2+信號的接收或轉(zhuǎn)導(dǎo)。AtGLR3.4基因在植株受到外界機械損傷刺激時表達量會增加3～6倍，細胞質(zhì)中酸中毒也可以誘導(dǎo)該基因的上調(diào)表達[12]，這些研究結(jié)果表明,AtGLR3.4基因可能參與了植物的抗逆反應(yīng)。Li等[13]研究報道，OsGLR3.1在維持水稻根尖分生組織細胞活力的過程中發(fā)揮重要作用。小蘿卜RsGLuR基因在擬南芥中超表達，可以提高植株抗真菌感染的能力[14]。

大豆是全世界種植面積最大的豆科植物，根瘤菌與大豆共生的生物固氮作用是世界農(nóng)業(yè)非常重要的組成部分，此外大豆還是世界范圍內(nèi)動物飼料蛋白和食用油的重要植物來源。2010年，大豆栽培品種美國的Williams 82(Glycine_max_v2.0) 基因組序列公布[15]，并成為當前參考應(yīng)用最多的大豆基因組序列。最近，我國科學(xué)家對國審大豆品種中黃13的基因組(Gmax_ZH13) 進行從頭組裝，最終得到1.025 Gb的基因組序列，包含20條染色體和1條葉綠體[16]。這些大豆基因組測序工作的完成為大豆基因的基礎(chǔ)性研究提供了很好的參考條件，很多大豆的基因家族在基因組中被鑒定和發(fā)掘，但是還沒有關(guān)于大豆GmGLRs基因相關(guān)信息的研究報道。本研究也是參考Williams 82(Glycine_max_v2.0) 基因組序列，在全基因組層面鑒定出GmGLRs基因，并就這些基因從生物信息學(xué)角度進行分析，同時也研究了它們的組織表達模式，為深入研究該家族成員的分子生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 GmGLRs基因的鑒定及序列分析

在TAIR(http://www.arabidopsis.org)獲取擬南芥AtGLRs的基因序列，以擬南芥的序列為探針在Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!infoalias=Org_Gmax)大豆基因組(Wm82.a2.v1)Blast，搜索獲得E值小于e-10的相似性序列，將獲得的序列(大豆和擬南芥)在InterProscan5 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)在線分析功能結(jié)構(gòu)域存在情況，最終確定目標序列。序列的轉(zhuǎn)錄名稱、編碼區(qū)長度、CDS序列長度、外顯子個數(shù)均在Phytozome獲得；利用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)在線分析獲得GmGLRs基因蛋白氨基酸序列的分子質(zhì)量、等電點等基本信息。

1.2 GmGLRs基因染色體定位

通過大豆基因組數(shù)據(jù)庫Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)獲得GmGLRs基因在大豆染色體上的位置信息，用Map Inspect軟件繪制基因的染色體物理分布圖。

1.3 GmGLRs基因構(gòu)建系統(tǒng)進化樹

GmGLRs蛋白質(zhì)氨基酸序列在Phytozome獲得，擬南芥AtGLRs蛋白序列在TAIR上獲取，用Mega 6 軟件采用Neighbor-Joining構(gòu)建大豆GmGLRs和擬南芥AtGLRs蛋白的系統(tǒng)進化樹，校驗參數(shù)Bootstrap=1 000。

1.4 GmGLRs基因結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

采用GSDS(Gene Structure Dispely Server，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線繪制大豆GmGLRs基因結(jié)構(gòu)圖[17]；大豆GmGLRs蛋白序列的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測在TMHMM Server v. 2.0;http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM在線進行。

1.5 GmGLRs基因組織表達模式分析

GmGLRs基因在花、葉、根瘤、豆莢、根、根毛、種子、頂端生長點、莖等9個組織部位表達量數(shù)據(jù)(FPKM)來自Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)[18]，將獲得數(shù)據(jù)log2均一化處理后，用HemI 1.0軟件繪制GmGLRs基因表達熱圖[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmGLRs基因鑒定及序列基本信息

利用擬南芥AtGLRs基因序列在Phytozome大豆基因組(Wm82.a2.v1)Blast，共鑒定出18個GmGLRs候選基因。將這18個候選基因在InterProScan上鑒別功能結(jié)構(gòu)域，因4個結(jié)構(gòu)域IPR001638、IPR001828、IPR001320和IPR017103在擬南芥AtGLRs基因中都存在(表1)，所以最后確定17個同時具有這4個結(jié)構(gòu)域的GmGLRs基因為GmGLR基因家族基因。

根據(jù)這17個GmGLRs基因在染色體上出現(xiàn)的先后順序分別命名為GmGLR1～GmGLR17(表2)，這些基因編碼區(qū)平均長度約為4 727 bp，最長的是GmGLR15的5 491 bp，最短的是GmGLR16的3 404 bp；CDS平均長度為2 748 bp，最長的是GmGLR7、GmGLR13和GmGLR14基因的2 844 bp，最短的是GmGLR6基因的2 409 bp；這些基因的外顯子個數(shù)除了GmGLR8基因有7個，其他都有6個外顯子。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析表明，17個GmGLRs基因的蛋白質(zhì)氨基酸序列個數(shù)平均為915個氨基酸，平均分子質(zhì)量是102.086 4 ku, 最大的是105.822 ku(GmGLR13)，最小的是91.405 ku(GmGLR5)；理論等電點最大的是GmGLR14的8.41，最小的是GmGLR8的6.17。只有GmGLR8的等電點小于7，說明該蛋白編碼弱酸性蛋白，將在亞細胞環(huán)境為酸性的條件下發(fā)揮功能[19]。

表1 InterPro 結(jié)構(gòu)域在大豆和擬南芥GLRs蛋白中的分布Tab.1 InterPro domains found in GmGLRs and AtGLRs

表2 GmGLRs基因家族基本信息Tab.2 Basic information of GmGLRs gene family of soybean

2.2 GmGLRs基因染色體定位分析

根據(jù)基因位置信息，將鑒定出的17個GmGLRs基因定位在大豆的10條染色體上，定位結(jié)果如圖1所示。這些基因在染色體上呈現(xiàn)不均勻分布，第9號和第12號染色體上各有3個GmGLRs基因，第6號、第7號和第13號染色體上各有2個GmGLRs基因，第1號、第4號、第11號、第14號和第16號染色體上都只有1個GmGLR基因。其中，第7號、第9號、第12號和第13號染色體的GmGLRs基因呈簇存在。

圖1 GmGLRs基因的染色體定位Fig.1 The chromosomal positions of GLRs gene in soybean

2.3 GmGLRs基因系統(tǒng)進化分析

為了分析GmGLRs基因的系統(tǒng)進化關(guān)系，利用GmGLRs蛋白質(zhì)序列同擬南芥的AtGLRs蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖2所示。擬南芥AtGLRs基因分成3個亞家族，第一亞家族4個基因，第二亞家族和第三亞家族分別是9，7個基因。GmGLRs有GmGLR5和GmGLR62個基因同擬南芥第二亞家族聚在一起，其他的15個GmGLRs基因同擬南芥第三亞家族聚在一起，沒有基因與擬南芥第一亞家族聚在一起。從進化樹末端聚類可以看出，17個GmGLRs基因存在8對同源基因，只有GmGLR16單獨一個分支。

圖2 大豆與擬南芥GLRs蛋白序列的系統(tǒng)進化樹Fig.2 The phylogenetic tree of GLRs protein in soybean and Arabidopsis

2.4 GmGLRs基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)搜索鑒定獲得17個GmGLRs基因的基因組編碼區(qū)序列和CDS序列，用GSDS 2.0軟件在線繪制GmGLRs基因結(jié)構(gòu)圖，同時分析這17個GmGLRs基因的外顯子和內(nèi)含子情況?？傮w來看，除GmGLR8基因，其他16個GmGLRs基因都包含6個外顯子和5個內(nèi)含子(圖3)。從外顯子的長度分析保守性，保守性較高的外顯子依次為E4、E3、E5，E4長度為32 bp的基因有14個，E3長度為278 bp的基因有13個，E5長度為407 bp的基因有9個(表3)。同源基因在基因結(jié)構(gòu)上也表現(xiàn)出高度一致，其中GmGLR1和GmGLR10、GmGLR12和GmGLR15、GmGLR13和GmGLR14，所對應(yīng)的外顯子長度都一樣；GmGLR2和GmGLR3、GmGLR7和GmGLR17，除E6以外的其他外顯子長度是一樣的；GmGLR4和GmGLR11，除E1和E6以外的外顯子長度是一樣的；同源基因長度不同的外顯子差異也不大，所對應(yīng)的內(nèi)含子的長度差別也不大(表3)。GmGLR8基因結(jié)構(gòu)差異的原因，可能是在進化過程中，第一個外顯子插入一個內(nèi)含子造成的。

圖3 GmGLRs基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 The diagram of extron and intron structure within GmGLRs

表3 GmGLRs基因外顯子和內(nèi)含子的比較Tab.3 Comparation of exons and introns in GmGLRs genes bp

2.5 GmGLRs跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

利用TMHMM Server v.2.0 在線預(yù)測GmGLRs 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，如表4所示，10 個GmGLRs蛋白有3個跨膜結(jié)構(gòu)域，4個GmGLRs蛋白有4 個跨膜結(jié)構(gòu)域，2 個GmGLRs蛋白有5個跨膜結(jié)構(gòu)域，1個GmGLRs蛋白有2 個跨膜結(jié)構(gòu)域。同源基因的跨膜結(jié)構(gòu)域在個數(shù)和位置上都表現(xiàn)高度一致，GmGLR2和GmGLR3、GmGLR7和GmGLR17，這3對等位基因跨膜結(jié)構(gòu)域的位置都一致；GmGLR1和GmGLR10、GmGLR12和GmGLR15，這2對等位基因?qū)?yīng)跨膜結(jié)構(gòu)域的位置只有幾個氨基酸的差異。GmGLRs 的跨膜位置多位于580-870 個氨基酸，該區(qū)域也是保守結(jié)構(gòu)域相對集中的區(qū)域，由此可見，跨膜結(jié)構(gòu)域在GmGLRs的生理功能上發(fā)揮重要作用。

2.6 GmGLRs基因組織表達模式分析

利用Phytozome 數(shù)據(jù)庫中GmGLRs基因的組織表達量數(shù)據(jù)(FPKM)，對GmGLRs基因在花、葉、根瘤、豆莢、根、根毛、種子、頂端生長點、莖等9個組織部位的表達模式進行分析，結(jié)果如圖4所示。17個GmGLRs基因的表達都沒有表現(xiàn)出組織特異性的差異，但是在表達豐度上存在顯著差異，有8個基因高豐度表達，5個基因中豐度表達，4個基因低豐度表達。同源基因具有相似的表達趨勢，GmGLR7和GmGLR17、GmGLR4和GmGLR11、GmGLR12和GmGLR15、GmGLR5和GmGLR6，這些同源基因在表達豐度和不同組織部位表達量上趨于一致。從不同組織部位表達高低的角度來看，GmGLR1在葉中表達量最高，GmGLR7在種子中表達量最高，GmGLR15在根中表達量最高，GmGLR12在頂端生長點中表達量最高，GmGLR8在花、葉和根中表達量最低，GmGLR6在根瘤、種子和頂端生長點中表達量最低。

表4 GmGLRs蛋白跨膜域預(yù)測Tab.4 Prediction of the transmembrane regions of GmGLRs proteins

F.花；L.葉；N.根瘤；P.豆莢；R.根；RH.根毛；Se.種子；SAM.頂端生長點；St.莖。 F.Flower;L.Leaves;N.Nodules;P.Pod;R.Root;RH.Root hair;Se.Seed;SAM.Shoot apical meristem;St.Stem.

3 結(jié)論與討論

結(jié)構(gòu)域是生物大分子中具有特異結(jié)構(gòu)和獨立功能的區(qū)域，也是蛋白質(zhì)功能單元[20]，具有相同結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)分子在理論上具有相同生物學(xué)功能的可能性最大。擬南芥AtGLRs所有的成員都具有IPR001638、IPR001828、IPR001320和IPR017103這4個結(jié)構(gòu)域，因此,在篩選其他植物基因組中GLRs的時候，也應(yīng)以此為參考[3]，所以本研究所最終確定的17個GmGLRs成員也是同時包含這4個結(jié)構(gòu)域。

擬南芥的AtGLRs基因根據(jù)系統(tǒng)進化的分析結(jié)果分成3個亞家族[21]，水稻的OsGLRs基因根據(jù)系統(tǒng)進化的結(jié)果分成4個亞家族，都有基因同擬南芥的3個亞家族聚類到一起，還有一個分支的7個基因有別于這3個亞家族[2]；番茄SlGLRs基因也分成3個亞家族，其中有2個亞家族同擬南芥的第二和第三亞家族聚類到一起，另一個亞家族單獨聚到一個分支[3]；蘋果的MdGLRs基因同擬南芥的系統(tǒng)進化結(jié)果一致，分成3個亞家族[4]。本研究結(jié)果顯示，大豆的GmGLRs基因只包含同擬南芥AtGLRs基因第二和第三亞家族聚類到一起基因，缺少同擬南芥AtGLRs基因第一亞家族一致的基因，而且17個GmGLRs基因有15個同擬南芥AtGLRs基因第三亞家族聚類在一起，表明大豆的GmGLRs基因在生理功能上可能更趨同于擬南芥AtGLRs基因第三亞家族。

先前的研究表明，植物GLRs多拷貝基因通常成串地排列在同一條染色體上[2,3,22]，大豆的GmGLRs基因也表現(xiàn)出了類似的特性。大豆基因組在進化過程中發(fā)生過大規(guī)模復(fù)制事件，使得大豆的很多基因表現(xiàn)出成對出現(xiàn)的分布模式[15,23-24]，大豆的17個GmGLRs基因有8對基因成對出現(xiàn)，也表現(xiàn)出了大豆基因的這一普遍規(guī)律。大豆的17個GmGLRs基因中的同源基因，不管是在基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)上，還是跨膜結(jié)構(gòu)域的存在形式上，以及基因組織表達模式上都表現(xiàn)出了高度一致性，表明這些基因的分子生物學(xué)功能也可能存在重復(fù)。