鄒斌華，鄭潔煌，李曉娟

在正常破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成之間，存在相互制約的骨重建維持機制，這一機制保持骨組織不斷更新。骨重建過程受激素及其他局部因素的調(diào)節(jié)，其重要的核心細胞——破骨細胞是體內(nèi)唯一負責骨吸收的細胞，破骨細胞活化和細胞融合是其行使骨吸收功能的關鍵過程[1]。研究表明，在骨質(zhì)疏松、類風濕性關節(jié)炎、腫瘤等誘導的骨破壞中，均存在破骨細胞過度活化[2-5]。破骨細胞被過度激活后加速骨質(zhì)吸收，導致骨丟失，引發(fā)反應性骨増生和骨折，進而引起疼痛，造成殘疾，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[6-7]。

目前骨質(zhì)疏松、類風濕性關節(jié)炎等破骨細胞相關骨破壞疾病患病人群龐大；而在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、白血病等惡性腫瘤疾病中，骨轉移造成的骨破壞也十分常見[8-11]。在破骨細胞分化過程中，破骨前體細胞（osteoclast precursor cell，OPC）發(fā)生細胞-細胞融合是形成多核破骨細胞的關鍵階段。因此，影響破骨細胞融合的形成或許是靶向調(diào)控破骨細胞生成藥物研發(fā)的一個新方向，對破骨細胞融合機制的深入研究，將為預防和治療骨質(zhì)疏松等骨破壞相關疾病提供新的方法和思路。本文對破骨細胞融合相關分子的研究進展進行文獻復習，現(xiàn)綜述如下。

1 破骨細胞融合過程

破骨細胞融合過程受時間和空間高度調(diào)控，蛋白質(zhì)相互作用和修飾、特殊基因途徑、激素、多種細胞因子及理化因子等因素均可對其融合過程造成影響。在多種因素刺激下，OPC表達融合相關分子后形成巨大的多核細胞，并最終分化為具有強骨吸收活性的成熟破骨細胞[12-13]。

目前研究較多的融合相關分子包括樹突狀細胞特異性跨膜蛋白（dendritic cells-specific transmembrane protein，DC-STAMP）、破骨細胞多次跨膜蛋白（osteoclast-stimulatory transmembrane protein，OC-STAMP）、ATP6vOd2、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、CD44、CD47、CD9、輕鏈鈣調(diào)蛋白結合蛋白（light-chain caldesmon，L-CaD）等。破骨細胞融合相關分子的缺失會導致多核破骨細胞生成減少，如DC-STAMP基因敲除小鼠出現(xiàn)骨硬化癥[14]、OC-STAMP缺陷小鼠出現(xiàn)破骨細胞及破骨細胞融合缺失等[15]。融合后的多核破骨細胞為極性細胞，可特化出許多特殊骨架結構，如封閉環(huán)、皺褶緣等，參與骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[16]。

2 破骨細胞融合的激活和調(diào)節(jié)機制

破骨細胞融合過程需要多種融合分子及信號通路的傳導，而各種融合相關分子及信號通路之間相互作用，導致破骨細胞融合調(diào)節(jié)機制較為復雜。目前已知核因子кB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-к B ligand，RANKL）介導的信號通路的激活，能誘導OPC融合形成巨大的多核破骨細胞[17]，而對破骨細胞融合調(diào)節(jié)機制研究較多的主要是微小RNA（micro RNA，miRNA）調(diào)控機制。

2.1 RANKL信號通路激活機制

RANKL和巨噬細胞集落刺激因子（macrophage-colony stimulating factor，M-CSF）是破骨細胞生成的必需因子。在破骨細胞生成過程中，RANK與RANKL結合，募集銜接分子TRAF6，而后激活蛋白激酶MAPK（ERK、JNK和p38）和核因子（nuclear factor，NF）-кB、激活蛋白（activator protein，AP）-1，上調(diào)活化T細胞核因子 c1（nuclear factor of activated T cells 1，NFATc1）早期表達；此外，RANKL信號通路可協(xié)同免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosinebased activation motif，ITAM）共刺激信號通路，激活磷脂酶C（phospholipase C，PLC）-γ2的磷酸化并引發(fā)鈣離子振蕩，促進NFATc1大量生成，增加破骨相關基因的表達，從而調(diào)節(jié)破骨細胞的分化、融合，促進骨吸收過程[18-22]。

2.2 miRNA調(diào)控機制

miRNA是一種調(diào)節(jié)性的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。有研究表明，miRNA能參與調(diào)節(jié)破骨細胞的生成，從而影響骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病的相關進程[23]。實驗證明，針對不同融合分子設計的RNA干擾分子，能在一定程度上抑制破骨細胞的融合：miR-30a通過靶向融合分子DC-STAMP直接調(diào)節(jié)破骨細胞的融合過程[24]；miR-7b-5p在破骨細胞分化和融合過程中直接靶向作用DCSTAMP，抑制NFATc1和c-Fos信號傳導，從而抑制成熟破骨細胞的細胞-細胞間融合形成等[25]；miR-1224也對破骨細胞形成具有重要作用，過表達miR-1224可導致c-Fos和NFATc1顯著增加，融合型破骨細胞數(shù)量也隨之提高[26]。

3 破骨細胞融合相關因子

3.1 DC-STAMP和OC-STAMP

3.1.1 DC-STAMP最早在人樹突狀細胞中發(fā)現(xiàn)的DC-STAMP是一種7次跨膜蛋白[27]，在物種間高度保守，人與鼠DC-STAMP同源性髙達90%[28]。

3.1.1.1 DC-STAMP在破骨細胞融合中的調(diào)控機制 目前普遍認為，DC-STAMP是破骨細胞融合過程的主要調(diào)控者[29-30]。在破骨細胞形成過程中，RANKL可誘導DC-STAMP表達升高，進而促進OPC脂雙層之間發(fā)生細胞-細胞融合，形成多核破骨細胞[29,31]。Yagi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在 RANKL 和M-CSF存在的條件下，DC-STAMP缺陷細胞不能產(chǎn)生多核破骨細胞，DC-STAMP基因敲除小鼠因缺乏功能性多核破骨細胞而表現(xiàn)出骨硬化癥表型；但采用逆轉錄病毒過表達DC-STAMP基因后，OPC融合增加。Iwasaki等[32]的研究亦證實，DC-STAMP轉基因小鼠破骨細胞融合、骨吸收增加，骨量降低。

Chiu等[27]發(fā)現(xiàn)，DC-STAMP細胞其細胞質(zhì)尾部存在一個免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM），可參與細胞信號的傳導過程。Yagi等[33]的研究結果顯示，NFATc1和c-Fos是DC-STAMP表達和破骨細胞融合過程中不可或缺的分子。過表達DC-STAMP可逆轉DC-STAMP缺陷細胞中NFATc1表達降低，且DC-STAMP細胞質(zhì)尾部的ITIM可借助調(diào)控細胞內(nèi)鈣離子濃度來調(diào)節(jié)破骨細胞的分化融合，人們推測DC-STAMP可能通過激活NFATc1-Ca2+軸來促進破骨細胞的生成[34-36]。

目前有關DC-STAMP影響破骨細胞生成的分子機制取得重大進展，但其配體研究未見報道。確定DC-STAMP配體，未來可能突破對破骨細胞分化和活化的認識，開辟破骨細胞生成研究新思路。

3.1.1.2 DC-STAMP與骨破壞 DC-STAMP與骨破壞疾病相關。在Paget's病患者中鑒定出DCSTAMP細胞質(zhì)尾部的易感突變區(qū)[37]，編碼DCSTAMP的基因TM7SF4發(fā)生基因突變[38-39]。而在牙周炎患者牙齦組織中，DC-STAMP基因表達明顯上調(diào)；對牙周炎小鼠局部及腹腔注射抗DC-STAMP單克隆抗體，多核破骨細胞生成和牙槽中骨吸收明顯減少，表明DC-STAMP在牙周炎骨丟失中具有重要作用[30]。正因為DC-STAMP與骨破壞疾病高度相關，使其可能成為抗骨破壞疾病藥物的作用靶點。

3.1.2 OC-STAMP OC-STAMP是一類6次跨膜蛋白，在破骨細胞生成過程中可被RANKL誘導表達[15,40]。 Yang等[41]運用OC-STAMP-siRNA及OCSTAMP抗體抑制OC-STAMP表達后，多核破骨細胞生成顯著減少；但在體外過表達OC-STAMP基因后，RAW264.7細胞融合的抑制效應被抵消。亦有學者發(fā)現(xiàn)，OC-STAMP缺陷小鼠表現(xiàn)出破骨細胞完全缺乏和細胞-細胞融合缺失[15]；Ishii等[42]的研究結果也證實，OC-STAMP缺陷小鼠牙周炎較WT小鼠骨吸收減少，使用抗OC-STAMP抗體能抑制體外多核破骨細胞的生成。

OC-STAMP和DC-STAMP除結構相似外，還具有很多共同特征。在RANKL刺激下，兩種蛋白在破骨細胞中的表達量均明顯升高；均能促進RANKL刺激下OPC間的融合；在加入抗體或使用siRNA進行基因干擾后都能抑制破骨細胞生成過程中的細胞融合，而對其進行過表達后，被siRNA抑制的破骨細胞融合消失均可恢復。需要強調(diào)的是，盡管DC-STAMP和OC-STAMP對破骨細胞生成至關重要，但它們是兩種不同類型的特異性蛋白，不可相互代替：DC-STAMP的缺失不能被OC-STAMP的過表達所補充，反之亦然[15]。DC-STAMP和OC-STAMP如何參與細胞-細胞融合過程中脂質(zhì)雙分子膜的分裂和再封閉，以及它們在破骨細胞生成信號級聯(lián)中的相互作用，均有待進一步的深入研究。

3.2 CD

白細胞分化抗原是不同階段、不同類型白細胞膜上的表面標記，主要是膜蛋白或膜糖蛋白。其可作為表面標志用于細胞分離與鑒定，也同時參與細胞生長、遷移、分化、成熟等生理過程的調(diào)節(jié)。在破骨細胞融合過程中，CD44、CD47、CD9等扮演了重要角色。

3.2.1 CD47整合素相關蛋白（IAP/CD47）與巨噬細胞之間的融合有關，主要在具有很少核的OPC細胞/破骨細胞表面表達[43]。CD47和信號調(diào)節(jié)蛋白α（signal regulatory protein alpha，SIRPa）之間的相互作用能調(diào)節(jié)細胞遷移與吞噬、細胞因子產(chǎn)生和巨噬細胞融合等過程[44]。

與野生型細胞相比，CD47缺陷小鼠OPC誘導生成的多核破骨細胞數(shù)量和骨吸收功能顯著降低[44]。而與野生型小鼠對比，CD47缺陷小鼠破骨細胞數(shù)量減少、骨礦物質(zhì)密度降低；對CD47缺陷小鼠骨髓基質(zhì)細胞中破骨細胞成熟標志物的測定則表明，破骨細胞融合功能出現(xiàn)缺陷[45]。

在加入CD47抗體后，小鼠破骨細胞之間的融合受到抑制，提示功能性破骨細胞的分化需要CD47的參與[45]。CD47缺陷小鼠明顯的骨骼表型及CD47體外效應表明，CD47在OPC融合生成多核破骨細胞過程中具有不可或缺的作用[44-45]，但其介導的具體信號通路還需要進一步研究。

3.2.2 CD9 CD9是一種4次跨膜糖蛋白，可在多種細胞類型中表達，參與調(diào)節(jié)配子膜融合、肌肉細胞融合、有髓軸突形成和吞噬細胞多核化等細胞運動和細胞融合過程。在RANKL刺激下，RAW264.7細胞表面CD9表達顯著增加；加入抗CD9抗體及siRNA靶向抑制CD9功能后，多核破骨細胞樣細胞明顯減少，破骨細胞融合受到抑制；而過表達CD9能促進破骨細胞自融合。此外，在卵巢切除引起的骨質(zhì)疏松小鼠模型中，多核破骨細胞表面發(fā)現(xiàn)大量CD9的表達[46]。

現(xiàn)有研究表明，細胞膜上的脂筏為蛋白之間的相互作用和構象轉變提供有利場所，在破骨細胞融合的過程中，其可通過共聚效應，促進促融合蛋白之間的相互作用，并將其聚集至肌動蛋白細胞骨架上，從而正向調(diào)控破骨細胞融合；破壞脂筏功能可明顯抑制多核破骨細胞的形成[46]。Ishii等[46]、Lee等[47]通過骨組織免疫組化研究，證實CD9定位于不溶性脂筏微區(qū)，從而推測CD9作為重要的融合相關分子之一，可能通過細胞膜上的脂筏參與破骨細胞之間的融合。

3.2.3 CD44單核巨噬細胞譜系細胞具有黏附、相互融合并分化成破骨細胞的能力，作為一種在造血細胞中發(fā)揮重要作用的膜糖蛋白，CD44通過介導細胞-細胞之間的相互作用來調(diào)控組織中巨噬細胞的單核狀態(tài)。體內(nèi)外證據(jù)表明，巨噬細胞在細胞-細胞間的黏附/融合開始時，表面CD44表達出現(xiàn)短暫性升高，加入CD44配體后，多核細胞形成減少，由此認為，CD44及其假定的同源細胞表面配體可能是參與細胞-細胞相互作用導致融合的潛在成員之一[48]。

3.3 ATP6v0d2

在RANKL誘導下，液泡（H+）ATP酶（v-ATPase）v0結構域的d2異構體（ATP6v0d2）在破骨細胞中高度表達。Lee等[49]發(fā)現(xiàn)，ATP6v0d2缺陷小鼠OPC融合明顯降低；與WT小鼠相比，ATP6v0d2基因缺陷小鼠骨髓腔空間減少、骨量顯著增加，多核破骨細胞數(shù)量大大減少，但抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色陽性單核細胞的數(shù)量略有增加；將ATP6v0d2缺陷OPC與野生型OPC混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)兩種細胞發(fā)生融合。這些證據(jù)表明，ATP6v0d2可能通過參與激活破骨細胞融合影響其成熟進程。

Chen等[50]發(fā)現(xiàn)，ATP6v0d2基因缺陷小鼠中成骨細胞生成和骨形成明顯增加，而成骨細胞分化和分化相關基因表達沒有發(fā)生改變，作者推測造成這一結果的原因可能是破骨細胞或其前體細胞改變后產(chǎn)生能正向調(diào)控成骨細胞生成的細胞外因子，進而提出ATP6v0d2可成為具有潛力的骨破壞治療藥物靶標。此外，ATP6v0d2能同時調(diào)節(jié)破骨細胞融合和成骨細胞骨形成，提示可通過靶向調(diào)節(jié)單個基因，在抑制破骨細胞成熟的同時誘導骨形成[49,51-52]。

3.4 E-鈣黏蛋白

上皮細胞表達的鈣離子依賴Ⅰ型跨膜糖蛋白——E-鈣黏蛋白，在細胞黏附、細胞間穩(wěn)定性和細胞運動中起重要作用[53-54]。在RANKL誘導的破骨細胞中，E-鈣黏蛋白表達顯著增加，而N-鈣黏蛋白或P-鈣黏蛋白則無此改變。Fiorino和Harrison[55]的研究結果顯示，在體外，隨TRAP染色陽性多核破骨細胞的增加，E-鈣黏蛋白表達相應升高；在破骨細胞發(fā)生融合前采用E-鈣黏蛋白中和抗體拮抗后，破骨前體RAW264.7細胞中TRAP、組織蛋白酶K、DC-STAMP和NFATc1的基因表達受到抑制，多核破骨細胞的生成明顯減少；而在RAW264.7細胞中過表達E-鈣黏蛋白后，多核破骨細胞的生成及NFATc1核轉位均增加，提示其在影響破骨細胞融合的同時，能調(diào)節(jié)破骨細胞的骨吸收功能。但涉及E-鈣黏蛋白調(diào)節(jié)的具體信號通路，目前知之甚少。

3.5 L-CaD

肌動蛋白細胞骨架重塑在骨吸收過程可能起到舉足輕重的作用，骨錨固和基質(zhì)降解的密封區(qū)就是由肌動蛋白細胞骨架重塑而成。L-CaD在調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架重塑中扮演重要角色，能夠穩(wěn)定肌動蛋白絲，抑制肌動蛋白ATP酶活性，從而保護肌動蛋白絲免受切割蛋白（如凝溶膠蛋白）的影響[56]。

Liou等[57]研究發(fā)現(xiàn)，在RANKL刺激的RAW264.7細胞中，L-CaD表達增加。Chan等[56]的研究結果亦表明，將L-CaD基因沉默，OPC融合減少，而對其過表達后，OPC融合增加；此外，L-CaD在OPC周圍形成肌動蛋白環(huán)結構，改變細胞擴散和細胞表面黏附力的機械性質(zhì)，促進其融合成多核破骨細胞。

有趣的是，在破骨前體細胞中表達的L-CaD可發(fā)生磷酸化，而L-CaD的表達水平和磷酸化程度均能影響RANKL誘導的破骨細胞分化：去磷酸化L-CaD的增加可促進RANKL誘導的破骨細胞融合，而磷酸化L-CaD增加則可抑制破骨細胞融合。這些研究均表明，L-CaD在促進RANKL誘導的破骨細胞融合過程中具有一定意義[56,58]。

3.6 其他融合相關分子

Meltrin-α、Pcdh7、dynamin、syncytin-1等均可參與破骨細胞融合過程的調(diào)控。Meltrin-α是一種融合型蛋白，可參與多核巨細胞及破骨細胞的形成[58]。在RANKL刺激下，破骨細胞中Pcdh7基因表達增加，抑制其基因表達后，破骨細胞融合受到抑制，融合相關基因DC-STAMP、OC-STAMP和ATP6v0d2的表達也同時降低，表明Pcdh7通過促進細胞-細胞融合，在破骨細胞生成中發(fā)揮作用[59]。亦有學者發(fā)現(xiàn)，在早期單核OPC融合過程中，dynamin和DC-STAMP可能參與OPC的融合過程，其表達均有所增加[60-61]。此外，在破骨細胞分化過程中，syncytin-1基因和蛋白表達明顯上升，但syncytin-1特異性參與破骨細胞融合，并不影響骨吸收[62]。

4 骨破壞疾病靶向治療思路

目前直接靶向調(diào)節(jié)破骨細胞分化治療骨破壞相關疾病的上市藥物主要是RANKL單克隆抗體，其能抑制經(jīng)典RANKL信號通路，阻止破骨細胞的分化和成熟[63]。然而，破骨細胞在不同分化階段有著不同的作用和功能[64-65]，比如OPC在成血管過程中發(fā)揮關鍵作用，精準靶控破骨細胞分化過程中的某一個具體階段，如破骨細胞融合過程，有助于減少破骨細胞靶向藥物的不良反應，提高治療效果，為破骨細胞相關骨破壞疾病制定理想的治療策略。比如，使用抗DC-STAMP單克隆抗體對結扎性牙周炎小鼠進行腹腔和局部注射，小鼠牙槽骨丟失均減少；但牙周炎小鼠牙齦組織中腫瘤壞死因子-α、白介素-1β和RANKL表達升高未受抑制，也就是說，采用針對DC-STAMP的新型治療方案在抑制小鼠牙周炎局部骨丟失的同時，并不影響小鼠本身對口腔細菌的適應性免疫，是一種較為合理的治療手段[30]。此外，許多惡性腫瘤通過誘導RANKL依賴及非依賴性通路促進破骨細胞生成，導致骨破壞，此時抑制破骨細胞生成中必須經(jīng)歷的細胞融合過程，也比單純抑制經(jīng)典RANKL依賴性信號通路更加有效。

目前對于破骨細胞融合相關的信號通路及調(diào)節(jié)分子的研究較少。盡管如此，通過RNA干擾技術，利用融合相關分子的特性設計miRNA，進而靶向調(diào)節(jié)破骨細胞的融合和骨吸收，已引起研究者的廣泛關注。人們根據(jù)DC-STAMP結構設計能抑制多核破骨細胞生成的miR-30a、miR-7b-5p等；融合相關蛋白多位于細胞膜，DC-STAMP、OCSTAMP、CD47、CD9、E-鈣黏蛋白等單克隆抗體均能在體外抑制多核破骨細胞的形成，具有抗體藥物的研發(fā)基礎；此外，破骨細胞生成后期——細胞融合階段對破骨細胞生成的關鍵作用，提示其相關調(diào)節(jié)分子極有可能成為破骨細胞生成抑制劑的作用靶點，目前也逐漸成為業(yè)界的研究熱點之一。

5 小結

骨組織中各種細胞的協(xié)同作用決定了骨重建的動態(tài)平衡，破骨細胞一旦被過度激活，將導致骨破壞疾病的發(fā)生。破骨細胞融合過程對于破骨細胞生成和骨破壞至關重要，而靶向調(diào)控影響破骨細胞融合的分子如DC-STAMP、OC-STAMP、白細胞分化抗原、ATP6vOd2、E-鈣黏蛋白、L-CaD等分子是探究破骨細胞相關疾病治療的新思路，然而現(xiàn)今對于破骨細胞融合相關分子的研究仍然較少。本文對影響破骨細胞融合相關分子進行綜述，旨在為破骨細胞相關疾病的預防和治療提供參考。今后工作的方向之一就是深入研究破骨細胞融合相關信號通路，為研發(fā)骨質(zhì)疏松、炎癥性骨破壞和腫瘤轉移誘導骨破壞的靶向藥物提供新的思路和方向。