(肇慶學院生命科學學院， 廣東 肇慶 526061)

植物種子萌發(fā)是一個復雜而有序的生理和形態(tài)發(fā)生過程，涉及多條重要代謝途徑。影響種子萌發(fā)的因素有很多，包括光照、溫度、CO2、營養(yǎng)條件以及土壤里的重金屬等[1]。種子活力是種子在發(fā)芽和出苗期間活性強度及特性的綜合體現(xiàn)，高活力種子發(fā)芽早、出苗迅速整齊，對不良環(huán)境的抵抗力強，具有明顯的生長優(yōu)勢和生產(chǎn)潛力，如何提高種子活力和萌發(fā)率是水稻農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上面臨的重要問題[2]。

作為信號分子，活性氧(reactive oxygen species， ROS)在種子萌發(fā)過程中扮演“兩面”角色，種子處于干燥狀態(tài)時，其中的活性氧ROS并不活躍，種子在吸脹后開始產(chǎn)生ROS，一方面ROS參與激素調控打破種子休眠，另一方面ROS的過量積累又會抑制萌發(fā)，而此時種子中的抗氧化系統(tǒng)將被激活用于清除ROS[3]。在種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)建成時，ROS與脫落酸(abscisic acid，ABA)和赤霉素(gibberellin，GA)存在交互作用[4-5]，ROS可能抑制ABA 由子葉向胚中的運輸從而促進萌發(fā)[6]。有研究認為，ROS可以激發(fā)GA的信號和(或)合成，改變 ABA/GA 的閾值從而促進種子萌發(fā)[7]。在植物中，ROS清除系統(tǒng)(包括酶促反應系統(tǒng)和非酶促反應系統(tǒng))的抗氧化能力是植物延緩衰老的重要機制，抗氧化的酶促反應系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)過氧化氫酶(catalase，CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbic acid peroxidase，APX)等，非酶促反應系統(tǒng)主要包括抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)、α-生育酚、谷胱甘肽和β-胡蘿卜素等[8]。種子在吸脹萌發(fā)時，細胞膜恢復其正常功能，阻止溶質外滲。內(nèi)部保護機制，如SOD、 POD 和 CAT等保護性酶系統(tǒng)得以激活，及時清除種子在貯藏過程中產(chǎn)生的劣變產(chǎn)物[9]。另一方面，AsA作為植物組織內(nèi)廣泛存在的高豐度小分子抗氧化劑，在誘導種子萌發(fā)、調節(jié)植株生長發(fā)育、調控植物衰老進程、植物病原體防御以及誘導開花中起重要作用[10]。已有研究表明，AsA可通過清除ROS減輕種子在自然失水和萌發(fā)條件下所產(chǎn)生的氧化脅迫[11]。目前對植物AsA的生物合成途徑已有較深入的了解，L-半乳糖途徑是公認的植物中AsA的主要合成途徑，在此途徑中L-半乳糖內(nèi)酯脫氫酶(L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase,GalLDH)直接氧化L-半乳糖內(nèi)酯生成AsA，是植物AsA生物合成途徑中最后一步的關鍵酶[12]。多種植物體內(nèi)AsA的含量與GalLDH的活性密切相關[13-14]，利用分子生物學手段對GalLDH進行調控是當前研究的熱點。此外，有研究表明，外源AsA處理會對植物的生長和結實產(chǎn)生影響，如小麥種子經(jīng)AsA溶液預處理后，植株的分蘗數(shù)、每穗成粒率、千粒重、結實率和收獲指數(shù)均有提高，植株的耐鹽能力也得到提高[15]。

最新研究結果顯示，水稻內(nèi)源AsA缺失與籽粒灌漿速率以及籽粒堊白的形成密切相關，GalLDH干涉使水稻籽粒的灌漿速度明顯下降、堊白度明顯增加，胚乳淀粉粒結構松散。AsA缺失導致水稻籽粒H2O2的積累、羥自由基清除能力以及總抗氧化能力的下降，進而影響籽粒灌漿過程中淀粉合成途徑關鍵酶的活性和相關基因的表達，最終導致籽粒灌漿速率、淀粉特性以及堊白度的改變[16]。近年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展，越來越多研究借助分子生物學手段探究種子萌發(fā)機理和調控種子萌發(fā)過程[1]。本試驗研究了外源ABA處理對GalLDH超表達轉基因水稻種子萌發(fā)過程中各項生理指標的影響，以期為探究內(nèi)源AsA對水稻種子萌發(fā)的影響及作用機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為水稻(OryzasativaL.)粳稻野生型品種中花 11(WT)和GalLDH超表達株系第5代純合子GO-2，均由華南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院彭新湘教授實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1種子萌發(fā)與處理

選取飽滿的GO-2和WT水稻種子，剝?nèi)シN皮，用0.1%氯化汞溶液消毒10 min后，用無菌水清洗8～10次，無菌水中浸泡24 h后置于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿50粒種子，加入5μmol·L-1的ABA溶液至濾紙濕潤(對照加無菌水)，每組設置4個重復，將培養(yǎng)皿放入(28±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中，進行為期9 d的萌發(fā)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后(記為0 d )開始記錄萌發(fā)情況，同時取樣進行相關指標測定，隨后每3 d觀察1次，記錄萌發(fā)率和種子的生長情況并取樣進行相關指標測定。

萌發(fā)率(%)=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

1.2.2測定指標及方法

1) AsA含量的測定。

AsA和脫氫抗壞血酸(dehydroascorbic acid，DHA)含量的測定參考 Kampfenkel等[17]的方法，稍作改進。稱取0.1 g不同萌發(fā)時期的水稻種子(含已長出的芽和根)，加入 1 mL預冷的 6%(W/V)三氯乙酸和少量石英砂，在冰浴中研磨成勻漿，勻漿液在12 000 r·min-1、4 ℃下離心15 min，收集上清液。AsA含量測定：取25μL上清液加入到0.5 mL反應體系中，混勻后放入42 ℃恒溫金屬浴中保溫40 min，于波長525 nm處測定OD值?？偪箟难岷繙y定：取25μL上清液加入到0.5 mL反應體系中，混勻后于42 ℃恒溫金屬浴中保溫15 min，再加入25μL 0.5%(W/V)N-乙基順丁烯二酰亞胺終止反應，其余步驟與測定AsA含量的反應步驟相同?？瞻讓φ沼?% 三氯乙酸代替上清液。同樣方法制作標準曲線后，分別計算AsA和總抗壞血酸含量，DHA含量為二者之差。

圖1 GalLDH超表達轉基因水稻種子的萌發(fā)過程

2) SOD 活性測定。

SOD活性測定參照Prochazkova[18]的方法。稱取0.1 g不同萌發(fā)時期的水稻種子(含已長出的芽和根)，分別加入1 mL預冷的0.05 mg·L-1磷酸緩沖液(pH=7.8)和少量石英砂，冰浴勻漿后，勻漿液在10 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，取上清液加入反應體系，15 min后于波長560 nm處測定OD值。定義吸收值每分鐘變化 1.0 為1個酶活性單位(U)。

3) POD 活性測定。

POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法[19]。稱取0.1 g不同萌發(fā)時期的水稻種子(含已長出的芽和根)，加入1 mL預冷的 0.05 mol·L-1磷酸緩沖液(pH=7.8)和少量石英砂，在冰浴中研磨成勻漿，勻漿液在10 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，取上清液加入反應體系，測定2 min內(nèi)470 nm處的OD值變化，定義光吸收值每分鐘變化1.0為1個酶活性單位(U)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2010 軟件和SPSS 19.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)為3 次測定平均值 ± SE 表示。平均值間的比較采用單因素方差分析方法 (One-way ANOVA) 。用 SigmaPlot 12.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 種子萌發(fā)率和萌發(fā)表型變化

圖1和表1的結果顯示，2種培養(yǎng)條件下，GalLDH超表達轉基因水稻(GO-2) 和WT 的種子均在24 h后(0 d)開始萌發(fā)，對照條件下，在0 d、3 d、6 d和9 d時GO-2種子的萌發(fā)率均顯著高于WT，尤其是在0 d，GO-2種子的萌發(fā)率為34.33%，為WT的1.43倍。此外，對照條件下的GO-2和WT種子均在3 d時開始大量萌發(fā)，到6 d時達到最高峰，分別為98.46%和95.49%。5μmol·L-1的ABA處理后，GO-2和WT種子0 d的萌發(fā)率分別比對照下降了11.31%和26.22%，差異顯著。此外，ABA處理條件下GO-2和WT種子的萌發(fā)和根芽的生長在0 d、3 d、6 d和9 d時均明顯比對照緩慢(圖1)，而且ABA處理條件下，在0 d和3 d時，GO-2種子的萌發(fā)率顯著低于WT，兩者的萌發(fā)率均在9 d時才達到最高峰，分別為93.02%和92.55%(表1)。

表1 ABA處理對GalLDH超表達轉基因水稻種子萌發(fā)率的影響

萌發(fā)時間/dWTWT+ABAGO-2 GO-2+ABA023.90±0.46l21.20±0.66m34.33±0.48j25.33±0.42k378.71±0.54g38.81±0.22 i83.99±0.36f58.52±0.80h695.49±0.51b89.02±0.51d98.46±0.56a87.14±0.44e995.56±0.44b92.55±0.35c98.48±0.36a93.02±0.14c

注:不同字母代表差異顯著(p<0.05)。下同。

2.2 種子萌發(fā)過程中AsA含量和氧化還原勢AsA/DHA變化

圖2結果顯示，0 d時，對照條件下的GO-2種子的AsA含量最高，約為0.03 mg·g-1，為WT的1.16倍，而ABA處理條件下GO-2和WT種子的AsA含量均顯著下降至同一水平，分別為對照的56.63%和67.14%。此外，對照條件下GO-2和WT種子的AsA含量在0 d至9 d期間呈現(xiàn)相同的變化趨勢，即均在3 d 時達到最高峰，隨之下降，在6 d和9 d時GO-2的AsA含量分別為WT的1.37倍和1.35倍，差異顯著。而ABA處理條件下GO-2和WT種子的AsA含量也在3 d達到最高峰后，在6 d回落到對照的水平，而在9 d時均顯著高于對照，分別為對照的1.12倍和1.29倍。

注: 圖中數(shù)據(jù)均為3次樣品重復的平均值 ± SE。圖2 GalLDH超表達轉基因水稻種子萌發(fā)過程中AsA的含量變化

另一方面，對照條件下，GO-2種子的AsA/DHA在3 d和6 d時均顯著低于WT，但在9 d時顯著高于WT。ABA處理條件下的GO-2種子的AsA/DHA則在0 d和9 d時均顯著高于WT，在3 d和6 d時均顯著低于WT。另外，0 d時，ABA處理條件下，GO-2種子的AsA/DHA顯著低于對照，3 d時兩者均顯著減低至同一水平，分別為0.25和0.28，無顯著差異。而在萌發(fā)后期(6 d和9 d)，ABA處理條件下的GO-2種子的AsA/DHA呈現(xiàn)明顯的上升變化，在9 d時AsA/DHA達1.05，明顯高于對照。此外，2種培養(yǎng)條件下，WT種子的AsA/DHA 在0 d至9 d期間呈現(xiàn)相同的變化趨勢，而且在0 d至3 d時，ABA處理條件下的WT種子AsA/DHA均顯著低于對照，但在9 d時顯著高于對照(圖3)。

圖3 GalLDH超表達轉基因水稻種子萌發(fā)過程中氧化還原勢AsA/DHA的變化

2.3 種子萌發(fā)過程中SOD和POD活性的變化

在0 d 的GO-2和WT種子內(nèi)均未檢測到SOD和POD的活性(數(shù)據(jù)未顯示)。從圖4可以看出，3 d至9 d時，對照條件下，GO-2種子的SOD活性均顯著低于WT。 ABA處理條件下，GO-2種子的SOD活性在3 d和9 d時均顯著低于WT，尤其是在3 d時，僅為WT的66.44%，而在6 d時，GO-2種子的SOD活性顯著高于WT，為WT的1.44倍。此外，ABA處理條件下，GO-2和WT種子在3 d時的SOD活性與對照相比均有提高，其中處理后的WT種子SOD活性為對照的1.73倍。此外，ABA處理后的WT種子的SOD活性在6 d和9 d時與對照相比顯著下降，尤其是在6 d時，僅為對照的68.55%，而ABA處理后的GO-2種子在6 d時SOD活性與對照無顯著差異，在9 d時則高于對照。

圖5結果顯示，3 d時，對照條件下，WT種子的POD活性顯著低于GO-2，為GO-2的78.40%，ABA處理后，WT種子的POD活性與對照無顯著差異，而GO-2種子的POD活性顯著上升，為對照的1.24倍。此外，對照條件下，WT種子的POD活性在6 d和9 d時都保持在較高的水平，6 d時為GO-2的1.21倍，9 d時與GO-2無顯著差異。ABA處理后，在6 d時WT和GO-2種子的POD活性與對照相比均顯著降低，分別降低至對照的82.50%和74.55%，而在9 d時只有GO-2下降至對照的62.94%，差異顯著。

圖4 GalLDH超表達轉基因水稻種子萌發(fā)過程中SOD活性的變化

圖5 GalLDH超表達轉基因水稻種子萌發(fā)過程中POD活性的變化

3 討 論

AsA在種子萌發(fā)過程中起著非常重要的作用，作為小分子抗氧化劑，AsA不但能夠有效清除細胞中的活性氧，還能提高植物的抗逆性，促進植物的生長[10]。已有實驗證實，GalLDH是AsA生物合成途徑最后一步的關鍵酶，在調控高等植物內(nèi)源AsA含量中起重要作用[12]。前期的研究結果顯示，抑制水稻GalLDH的表達后，AsA缺失轉基因植株GI-1和GI-2葉片的CO2同化率與野生型相比下降了50%～60%，葉片的Rubisco蛋白含量明顯降低，僅分別為野生型的20%和70%，結實率也明顯下降，空癟粒增多[20]，而GalLDH超表達轉基因水稻植株GO-2(植株葉片AsA含量上升約20%)葉片的CO2同化率與野生型相近, 但分蘗期和灌漿期葉片的Rubisco蛋白含量顯著高于野生型, 成熟籽粒的堊白度下降明顯，僅為野生型的66%[16]。

研究發(fā)現(xiàn)，外源AsA處理能夠提高植物種子的萌發(fā)率，但對于不同植物，外源AsA對種子萌發(fā)的促進存在不同最佳濃度，如0.5 mmol·L-1AsA處理對黃芩(Scutellariabaicalensis)種子萌發(fā)的促進作用最明顯，濃度過高反而起抑制作用[21]。尚瑞廣等研究表明，在瑪咖(LepidummeyeniiWalp.)陳種子萌發(fā)過程中，添加外源AsA的最佳濃度為300 mg·L-1，濃度過高會使種子的呼吸作用增強，種子的活力受到抑制[22]。本研究中GalLDH超表達轉基因水稻(GO-2)種子的內(nèi)源AsA含量比WT提高約20%(圖2)，萌發(fā)率也顯著高于WT(表1)，這與前人報道通過外源施加AsA的結果一致，充分說明內(nèi)源AsA含量的增加確實有助于提高水稻種子的萌發(fā)率。近年來的相關研究表明，在生理成熟期后的脫水階段，ABA參與了種子活力的形成，增加了種子對逆境的適應能力[23-24]。研究發(fā)現(xiàn)，ABA溶液浸種對白粒小麥種子萌發(fā)具有明顯的抑制作用，濃度為80～100 mg·L-1的ABA處理能延緩白粒小麥萌發(fā)2 d以上，ABA處理后白粒小麥幼苗的AsA含量明顯高于對照[25]。另有研究結果顯示，用5μmol·L-1的ABA處理去殼水稻種子48 h后，種子的AsA含量顯著低于對照水平[26]；5～50μmol·L-1ABA處理對水稻種子萌發(fā)過程中根和芽的生長速率具有顯著的抑制作用[27]；濃度>5 mg·L-1的ABA對水稻種子和根、芽的伸長生長具有明顯的抑制作用[28]；10 mg·L-1ABA 處理則嚴重抑制種子萌發(fā)和地上部伸長生長[29]。ABA和GA是調節(jié)植物生長發(fā)育的重要激素，分別具有抑制和促進植物生長的作用，AsA作為GA生物合成途徑中酶的底物，參與調控水稻種子的萌發(fā)[30]。王熹等研究發(fā)現(xiàn)，用ABA 處理后水稻種子呼吸峰滯后并有所下降，種子發(fā)芽受到抑制，芽谷中內(nèi)源GA1無顯著變化[31]。本研究中，5μmol·L-1的ABA處理后，GO-2和WT水稻種子的萌發(fā)率顯著低于對照，在萌發(fā)前期(0 d和3 d)，ABA處理對WT種子萌發(fā)的抑制作用更為顯著(圖1，表1)。ABA處理后WT和GO-2種子的AsA含量在0 d(ABA處理24 h)時顯著低于對照水平，而在萌發(fā)后期(9 d)明顯高于對照(圖2)，分別與前人以水稻種子[26]和白粒小麥[25]為研究材料的研究結果相近。林程等研究發(fā)現(xiàn)，ABA和GA比值越高，水稻種子發(fā)芽能力越弱[32]。本研究結果表明，5μmol·L-1的ABA能有效抑制水稻去殼種子的萌發(fā)，而內(nèi)源AsA含量的提高可能打破了萌發(fā)相關的激素(ABA和GA)之間的平衡，提高了種子的萌發(fā)率。

AsA可通過清除ROS來減輕種子在自然失水和萌發(fā)條件下所產(chǎn)生的氧化脅迫[11]。研究發(fā)現(xiàn)，正常種子在干燥失水之前合成小分子抗氧化劑AsA，用于抵抗種子內(nèi)部由于干燥所觸發(fā)的氧化脅迫。當種子吸水后，種胚中含有的DHA和大量DHA還原蛋白快速生成AsA， AsA便開始積累[33]。隨著種子的萌發(fā)和根芽的伸長，當植物細胞中AsA生物合成途徑的酶被激活合成AsA后，還原蛋白活性開始下降[34]。在本研究中，ABA處理和對照條件下GO-2種子的AsA含量在3 d時與0 d時相比大幅提高(圖2)，但其氧化還原勢AsA/DHA卻在3 d時急劇下降(圖3)，說明2種培養(yǎng)條件下的GO-2種子均在3 d時合成了較多的DHA，總AsA含量明顯高于WT，造成氧化還原勢AsA/DHA顯著降低。

另一方面，SOD和POD是植物體內(nèi)酶促活性氧自由基清除系統(tǒng)的重要成員，它們的活性大小與作物的抗逆性密切相關[35]。SOD可以催化超氧自由基的歧化反應，其活性與高等植物的抗逆性和植株的衰老有密切關系[36]。正常情況下，生物體總是不斷地產(chǎn)生少量超氧陰離子，而SOD在不斷地將其清除，外界因子誘導SOD合成量增加的現(xiàn)象已有較多報道。黃益洪等認為，ABA浸種處理后白粒小麥幼苗葉片的SOD 酶活性增強[25]。本研究結果顯示，對照條件下的WT種子在萌發(fā)期3 d至9 d的SOD活性均比GO-2高，這可能與GO-2種子AsA含量的上調有關(圖4，圖2)。另外，不同萌發(fā)時期ABA處理和對照條件下的GO-2種子的SOD活性比較接近，但在6 d時與3 d時相比均有較大幅度的提高(圖4)，這有可能與6 d時GO-2種子中AsA含量的回落(圖2)以及氧化還原勢AsA/DHA的提高(圖3)有關系。另外，對照條件下的GO-2和WT種子的POD活性變化與SOD活性的變化相同，均為萌發(fā)初期低于后期，而ABA處理后GO-2種子和WT種子的POD活性呈現(xiàn)出萌發(fā)初期高于后期的變化，與SOD活性的變化相反；同樣，ABA處理后WT種子的POD活性變化也與SOD活性的變化相反，但為萌發(fā)初期低于后期(圖4，圖5)。以上研究結果說明，不同內(nèi)源AsA含量水稻種子的SOD和POD對ABA處理存在不同的響應機制。已有研究報道，不同含水量的水稻種子經(jīng)5 ℃貯藏12個月后，SOD和POD活性變化與種子活力變化整體一致，種子活力越低，POD和SOD活性也相對較低。POD是種子萌發(fā)期間的重要酶，主要作用是清除 H2O2，降低氧化作用對生物膜造成損傷，維持種子活力[2]。朱世楊和洪德林的研究結果表明： SOD、POD和CAT與種子活力極顯著正相關[37]。而鐘希瓊等對7個自然老化的水稻品種的研究認為，種子活力指標與POD和CAT 活性的差異不呈線性相關[38]。

綜上所述，正常培養(yǎng)條件下，GO-2種子的內(nèi)源AsA含量顯著高于WT，萌發(fā)率也顯著高于WT，說明在一定范圍內(nèi)提高水稻種子內(nèi)源AsA的含量有利于增強種子活力，提高種子萌發(fā)率。此外，ABA處理對萌發(fā)前期WT種子萌發(fā)的抑制作用更為明顯，說明內(nèi)源AsA含量與水稻種子萌發(fā)過程密切相關，內(nèi)源AsA含量的提高可能打破了萌發(fā)相關的激素之間的平衡，提高了種子的萌發(fā)率。在種子的萌發(fā)過程中GO-2和WT中的SOD和POD活性大小、變化以及對外源ABA的響應存在差異，說明內(nèi)源AsA與抗氧化酶系統(tǒng)共同參與調控水稻種子的萌發(fā)，進一步證實了內(nèi)源AsA在水稻種子活力保持以及種子萌發(fā)中的重要作用，但AsA含量上調的GO-2種子中SOD和POD活性對外源ABA如何響應，這些酶的活性又是受什么基因的控制或影響等，有待進一步的深入探討。