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(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院， 廣州 510006； 2.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院， 廣州 510006；3.廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥信息工程學(xué)院， 廣州 510006；4.廣州大學(xué)城健康產(chǎn)業(yè)科技園投資管理有限公司， 廣東 廣州 510006)

益智為姜科山姜屬植物益智(AlpiniaoxyphyllaMiq)的成熟果實(shí)。主要產(chǎn)于海南、廣東、福建、廣西、云南等地。其性溫味辛，歸脾胃經(jīng)，具有溫脾止瀉，攝唾涎，固精縮尿之功效[1]，為中國“四大南藥”之一，被衛(wèi)生部列為藥食同源的中藥材。益智的主要化學(xué)成分為萜類，苷類化合物、黃酮類、二芳基庚烷類以及鋅、銅、鐵、錳、鎳、鈷、鎂、鈣等微量元素[2-5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，益智具有抗炎[6]、抗過敏[7]、抗?jié)僛8]、降低血糖水平[9]、抗氧化[10-11]、抗癌[12]作用。在2015年版《中國藥典》中規(guī)定了益智的灰分和揮發(fā)油的含量，由此可見它們是影響藥材質(zhì)量的主要因素。益智種子很小，肉眼難以觀察到種子的表面性狀。微性狀研究是利用景深合成技術(shù)對不同聚焦的圖像進(jìn)行景深合成進(jìn)而獲得一幅各區(qū)域都清晰的全景深圖像，能更加全面、直觀、形象地展示出物體的整體，并可觀察到一些細(xì)微特征。李靜等[13]研究了寧夏枸杞的果實(shí)和種子的微性狀，結(jié)果特征明顯，能夠評價不同產(chǎn)區(qū)寧夏枸杞的商品品質(zhì)。本研究第1次采用微性狀方法研究了益智種子的表面紋理，并對不同產(chǎn)地的益智種子質(zhì)量進(jìn)行了研究，旨在為益智種子的鑒定與品質(zhì)評價提供依據(jù)。

圖1 總灰分含量測定流程圖

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)材料于2018年6—7月分別采集于廣東省陽江市陽東縣大八鎮(zhèn)，廣東省云浮市羅定市龍灣鎮(zhèn)，海南瓊中縣烏石鎮(zhèn)，廣西省梧州市岑溪市大業(yè)鎮(zhèn)，海南萬寧縣興隆鎮(zhèn)等5個種植基地。所有樣品經(jīng)廣東藥科大學(xué)姬生國教授鑒定為姜科植物益智的干燥、成熟果實(shí)。藥材經(jīng)手工去殼后獲得益智種子。部分種子粉碎過50目篩，保存于自封袋中，置干燥器中備用。

1.2 方 法

1.2.1微性狀研究

通過轉(zhuǎn)接環(huán)將單反相機(jī)鏡頭(尼康D 750相機(jī)、尼康105 mm F/2.8G VR微距鏡頭、太苦瑪轉(zhuǎn)接環(huán))和長工作距離物鏡(三豐M plan Apo 5×物鏡)連接起來組裝了一臺簡易顯微鏡用于拍攝不同產(chǎn)地益智種子，以研究種子的微性狀。首先計(jì)算組裝的簡易顯微鏡的景深。三豐M plan Apo 5×物鏡(NA=0.14)的景深為28μm，拍攝時步長可設(shè)定為15μm。然后使用軟件Helicon Focus 6.0對拍攝的不同聚焦圖像進(jìn)行景深合成。

1.2.2總揮發(fā)油提取的單因素考察

1) 加水量對揮發(fā)油提取的影響。取海南萬寧益智種子樣品粉末20 g，記為m，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入沸石粒，再分別加入樣品粉末重量的8倍、10倍、12倍、14倍、16倍量水，置電熱套中緩緩加熱至沸，并保持微沸提取5 h，再停止加熱。然后放置片刻，開啟測定器下端的活塞，將水緩緩放出，至油層上端到達(dá)刻度0線上面5 mm處為止。放置1 h以上，再開啟活塞使油層下降至其上端恰與刻度0線平齊，讀取揮發(fā)油量M。根據(jù)公式計(jì)算種子中的揮發(fā)油百分含量。

揮發(fā)油含量(%)=(M/m)×100%。

2) 浸泡時間對揮發(fā)油提取的影響。取海南萬寧益智種子樣品粉末20 g，記為m，加10倍量水。分別浸泡1、2、3、4、5 h，再提取5 h。提取完成后靜置1 h后，讀取揮發(fā)油量M。根據(jù)公式計(jì)算種子中的揮發(fā)油百分含量。

3) 提取時間對揮發(fā)油提取的影響。取海南萬寧益智種子粉末20 g記為m，再加14倍量水，浸泡4 h，分別提取2、4、6、8、10 h，提取完成后靜置1 h后，讀取揮發(fā)油量M。根據(jù)公式計(jì)算種子中的揮發(fā)油百分含量。

1.2.3揮發(fā)油提取的正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將影響益智種子揮發(fā)油提取率的3個因素，根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)三因素、三水平的L9(33)的正交實(shí)驗(yàn)。因素水平見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

水平因素A(加水倍數(shù))B(浸泡時間/h)C(提取時間/h)113352144631557

稱取海南萬寧益智種子粉末20 g，按所設(shè)正交因素水平表進(jìn)行揮發(fā)油提取。

1.2.4總揮發(fā)油的測定

取益智種子樣品粉末20 g置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入300 mL水與沸石粒,振搖混合后，浸泡4 h。置電熱套中緩緩加熱至沸，并保持微沸5 h，提取完成后，靜置1 h以上，讀取揮發(fā)油量，并計(jì)算樣品中揮發(fā)油的含量。

1.2.5總灰分和酸不溶性灰分的測定

采用《中國藥典》2015年版通則2302規(guī)定方法中“總灰分測定法”對益智種子的總灰分含量進(jìn)行測定，具體操作流程見圖1。根據(jù)殘?jiān)亓?，?jì)算供試品中總灰分含量。

圖2 不同產(chǎn)地的益智仁微性狀圖

取上項(xiàng)所得的灰分，在坩堝中加入稀鹽酸約10 mL，坩堝上面用表面皿覆蓋，水浴加熱10 mim，用5 mL熱水沖洗表面皿，洗液并入坩堝中，用無灰濾紙濾過，坩堝內(nèi)的殘?jiān)盟从跒V紙上，并洗滌至洗液不顯氯化物反應(yīng)為止。濾渣連同濾紙移置同一坩堝中，干燥，熾灼至恒重。根據(jù)殘?jiān)亓?，?jì)算益智種子中酸不溶性灰分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 微性狀研究

通過自制簡易顯微鏡拍攝了廣東陽江、廣東云浮、廣西梧州、海南瓊中4個產(chǎn)地益智種子的微性狀。結(jié)果見表2和圖2。2015年版《中國藥典》中對益智種子的性狀描述僅有種子的顏色、形狀和假種皮顏色，缺乏更加細(xì)微的種子性狀描述。由微性狀結(jié)果可知，不同產(chǎn)地的微性狀共同特征為：種子近圓餅型；種脊溝狀；種臍黃棕色，圓形；具有假種皮，假種皮上可見條紋；種子表面有點(diǎn)狀凸起和細(xì)皺紋。不同特征為：廣東陽江和廣西梧州的種子顏色較廣東云浮和海南瓊中的要偏紅，并且廣東陽江和廣西梧州的種子表面點(diǎn)狀凸起較廣東云浮和海南瓊中明顯。本研究通過自制顯微鏡可以觀察并記錄肉眼難以觀察到的種子表面點(diǎn)狀凸起，細(xì)皺紋和假種皮的條紋等性狀，微性狀結(jié)果特征明顯。

表2 不同產(chǎn)地益智種子性狀鑒別要點(diǎn)

性狀廣東陽江市廣東云浮市廣西梧州市海南瓊中縣假種皮淡棕色,較薄,有條紋黃棕色,厚,有條紋黃棕色,厚,有條紋深棕色,厚,有條紋種子顏色紅棕色棕褐色紅棕色深褐色種子形狀近圓餅型近圓餅型近圓餅型不規(guī)則型或近圓餅型種脊淺溝狀,較明顯溝狀,明顯溝狀,明顯溝狀,明顯種臍黃棕色,圓形黃棕色,圓形黃棕色,圓形黃棕色,圓形種子表面密布點(diǎn)狀凸起,且明顯,有細(xì)皺紋有點(diǎn)狀凸起,有細(xì)皺紋密布點(diǎn)狀凸起,且明顯,有細(xì)皺紋有點(diǎn)狀凸起,細(xì)皺紋不明顯

2.2 總揮發(fā)油提取的單因素考察

1) 加水量對揮發(fā)油提取的影響。以加入益智種子粉末重量的倍數(shù)水量為橫坐標(biāo)，揮發(fā)油含量為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果見圖3。由圖3可知，揮發(fā)油含量隨著加水量的增加先增加后減少。當(dāng)加水量為14倍時揮發(fā)油含量最大，為1%。

圖3 加水量對揮發(fā)油提取的影響

2) 浸泡時間對揮發(fā)油提取的影響。以益智種子粉末加水浸泡的時間為橫坐標(biāo)，揮發(fā)油含量為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果見圖4。由圖4可知，揮發(fā)油的含量隨著浸泡時間的增加，先增加，后減少。當(dāng)浸泡時間為4 h時揮發(fā)油含量最高，為0.94%。

3) 提取時間對揮發(fā)油提取的影響。以微沸提取時間為橫坐標(biāo)，揮發(fā)油含量為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果見圖5。由圖5可知，揮發(fā)油的提取量隨著提取時間的增加，先增加后趨于穩(wěn)定，在6 h時揮發(fā)油含量最高，為1%。

圖4 浸泡時間對揮發(fā)油提取的影響

圖5 提取時間對揮發(fā)油提取的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

由表3所示的每個因素各個水平的平均得率可知，各因素對實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響大小不一致。用1個因素各個水平均數(shù)的極差R來反映各因素發(fā)生水平變動時對指標(biāo)的影響程度大小，R數(shù)值越大，對揮發(fā)油提取的影響程度更大。按照表3中R的計(jì)算結(jié)果可知，A為揮發(fā)油提取的主要影響因素，B、C為次要考慮的影響因素，次要因素則可根據(jù)時間、成本、效率等方面的考慮而選擇適當(dāng)?shù)乃?。藥材浸泡過久容易變質(zhì)且增加了實(shí)驗(yàn)時間成本，并由單因素實(shí)驗(yàn)可知，藥材在浸泡4 h時揮發(fā)油的提取量為最大。故適當(dāng)選擇B2為最佳的提取因素。因此最佳的提取工藝為A3B2C1即加15倍水，浸泡4 h，提取5 h。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

編號A(加水倍數(shù))B(浸泡時間)C(提取時間)揮發(fā)油含量/(mL·g-1)11110.95021220.97531331.00042120.92552230.97562311.05073131.12883211.12593321.125K10.9751.0011.042K20.9831.0251.008K31.1261.0581.034R0.1510.0570.026

2.4 總揮發(fā)油的測定

最優(yōu)的正交實(shí)驗(yàn)條件提取的不同產(chǎn)地?fù)]發(fā)油的含量見表4。4個產(chǎn)地的揮發(fā)油含量均達(dá)到2015版《中國藥典》中規(guī)定的種子含揮發(fā)油不得少于1.0%(mL·g-1)的標(biāo)準(zhǔn)。廣西梧州的揮發(fā)油含量最高，為1.86%，廣東云浮的揮發(fā)油含量最低，為1.35%。

2.5 總灰分含量和酸不溶性灰分含量的測定

由表4可知。4個產(chǎn)地的總灰分含量和酸不溶性灰分含量符合2015年版《中國藥典》中規(guī)定的種子總灰分含量不得超過8.5%，酸不溶性灰分含量不得超過1.5%的標(biāo)準(zhǔn)。其中廣東陽江的總灰分含量最低，為3.20%，廣西梧州的酸不溶性含量最低，為1.03%。

表4 不同產(chǎn)地益智種子的成分含量

指 標(biāo) 廣東陽江市廣東云浮市廣西梧州市海南瓊中縣揮發(fā)油含量/%1.741.351.861.69總灰分含量/%3.205.074.514.60酸不溶性含量/%1.191.481.031.34

3 討 論

微性狀研究具有方法簡單，結(jié)果準(zhǔn)確直觀等優(yōu)點(diǎn)，在中藥領(lǐng)域已有一定的應(yīng)用，當(dāng)前研究主要集中在易混淆藥材及飲片的性狀鑒別，藥用植物及中藥材圖鑒等方面。不同產(chǎn)地的益智種子微性狀具有一定的差別，這可能由于不同產(chǎn)地的益智生長的氣候環(huán)境不一樣所致。在揮發(fā)油提取時，容易出現(xiàn)揮發(fā)油的乳化現(xiàn)象，使油與水不能完全分層，從而影響揮發(fā)油含量數(shù)據(jù)的讀取。這可能是在提取過程中出現(xiàn)爆沸現(xiàn)象引起，應(yīng)該控制提取的溫度并加入沸石，出現(xiàn)爆沸現(xiàn)象應(yīng)立即停止加熱。提取完成后，揮發(fā)油提取器因放冷靜置1 h使揮發(fā)油與水完全分離，以保證揮發(fā)油讀數(shù)的準(zhǔn)確。本研究結(jié)果表明，4個產(chǎn)地益智種子的揮發(fā)油含量，總灰分和酸不溶性灰分的含量均符合藥典的規(guī)定。益智的主要活性成分為揮發(fā)油，種子揮發(fā)油的含量高低可以做為評價益智種子品質(zhì)好壞標(biāo)準(zhǔn)之一。廣西梧州、廣東陽江、海南瓊中、廣東云浮的揮發(fā)油含量分別為1.86%、1.74%、1.69%、1.35%，說明廣西梧州和廣東陽江的品質(zhì)比較好。益智的微性狀鑒定結(jié)果清晰準(zhǔn)確，種子表面的點(diǎn)狀凸起可作為區(qū)分同屬植物的區(qū)別點(diǎn)。廣東陽江和廣西梧州的種子為紅棕色并且種子表面具有明顯的點(diǎn)狀凸起。關(guān)聯(lián)益智種子中的揮發(fā)油成分可知，種子顏色為紅棕色，并且有明顯的點(diǎn)狀凸起，比棕褐色并沒有很明顯的點(diǎn)狀凸起揮發(fā)油含量高，品質(zhì)好。種子表面的顏色和點(diǎn)狀凸起可作為區(qū)分益智種子品質(zhì)好壞的鑒別點(diǎn)之一。益智種子的微性狀較明顯，還可以作為區(qū)分同屬其它藥材種子的鑒別特征。本研究結(jié)果為鑒別區(qū)分益智品質(zhì)好壞和真?zhèn)翁峁┝藚⒖家罁?jù)。

本研究第一次利用微性狀對益智種子的表面特征進(jìn)行了描述，其結(jié)果較明顯，可以作為區(qū)分益智種子的品質(zhì)好壞和真?zhèn)蔚蔫b別特征。其方法具有簡便易行、結(jié)果直觀準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。本研究可以為拓寬中藥學(xué)的研究領(lǐng)域，增加中藥學(xué)的研究手段，提供一種新的借鑒方法，并為益智種子的質(zhì)量評價體系的建立提供一個基礎(chǔ)。