黃敏興，高裕鋒，甄振鵬，李碩聰，龐揚(yáng)海，王小鵬，余構(gòu)彬

(廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所)，廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家糖業(yè)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，中國(guó)輕工業(yè)甘蔗制糖工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州，510316)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbonate,EC)是食品在發(fā)酵工藝中形成的天然副產(chǎn)物，主要存在于面包、酸奶、釀造醬油、食醋、豆豉等發(fā)酵食品中[1]。由于發(fā)酵食品中基本含有氨甲酰類物質(zhì)，該類物質(zhì)發(fā)生醇解反應(yīng)時(shí)則生成氨基甲酸乙酯[2-3]。研究表明，氨基甲酸乙酯可誘發(fā)體細(xì)胞染色體改性，致使基因突變[4-8]；同時(shí)氨基甲酸乙酯屬于多位點(diǎn)致癌物質(zhì)，若長(zhǎng)期攝入，可誘發(fā)多系列癌癥，如肝癌、肺癌、淋巴癌、皮膚癌等[9-12]。2007年，氨基甲酸乙酯的致癌等級(jí)被確認(rèn)為2A級(jí)[13]。因此為監(jiān)測(cè)面包中氨基甲酸乙酯含量，開發(fā)快速、高效、穩(wěn)定、靈敏度高的面包中氨基甲酸乙酯含量檢測(cè)方法具有重要意義。

目前氨基甲酸乙酯的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[14-15]、氣相色譜質(zhì)譜法(gas chromatograph-mass spectrometry,GC-MS)[16-19]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,HPLC-MS/MS)[20]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,GC-MS/MS)[21]等。由于面包基質(zhì)較為復(fù)雜，富含蛋白質(zhì)、油脂等，氨基甲酸乙酯本身分子量小，單一色譜法靈敏度相對(duì)較低、定性功能較差，易受雜質(zhì)干擾，若發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品還需色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)。GC-MS法是目前最常用的檢測(cè)方法，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)也采用該方法實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中氨基甲酸乙酯的測(cè)定，但是該方法基質(zhì)干擾大、選擇性較差[16-19]；GC-MS/MS法通過(guò)采集離子對(duì)的方式，較GC-MS法選擇性顯著增強(qiáng)，靈敏度較高[21]。常見(jiàn)的GC-MS和GC-MS/MS離子源有化學(xué)電離源(chemical ionization,CI)和電子轟擊源(electron ionization,EI)2種，CI源靈敏度更高、選擇性更強(qiáng)，而且受柱流失和基質(zhì)成分影響低，定性定量分析優(yōu)勢(shì)更為明顯[22-24]。本文擬采用GC-MS/MS法結(jié)合正化學(xué)電離源(positive chemical ionization,PCI)模式，建立面包中氨基甲酸乙酯含量的GC-PCI-MS/MS測(cè)定方法，提升目標(biāo)物檢測(cè)選擇特異性和靈敏度，為面包中痕量氨基甲酸乙酯的準(zhǔn)確檢測(cè)提供有利的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0%)，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.5%)，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；乙酸鉛(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠；石油醚、乙醇、乙酸乙酯(色譜純)、有機(jī)相濾膜(0.22 μm)，彼西絡(luò)(廣州)科技有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-正化學(xué)源-串聯(lián)質(zhì)譜儀(7890B氣相色譜儀配7000D質(zhì)譜儀)，美國(guó)安捷倫公司；VT-WAX色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，廣州太瑋科技有限公司；Vortex-Genie 2旋渦混勻器，奧然科技有限公司；冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Cleanert EC堿性硅藻土固相萃取柱，天津博納艾杰爾科技有限公司；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件

進(jìn)樣口溫度：230 ℃；載氣：高純氦氣(99.999%)；碰撞氣：高純氮?dú)?99.999%)；柱流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL。升溫程序：起始溫度50 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至170 ℃，再以30 ℃/min升至240 ℃，保持3 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：正化學(xué)源；電離方式：化學(xué)電離；離子源溫度：300 ℃；檢測(cè)方式：質(zhì)譜多反應(yīng)檢測(cè)(multiple realtion monitoring,MRM)模式；色譜-質(zhì)譜連接口溫度：250 ℃；定性、定量離子對(duì)、碰撞能量等參數(shù)見(jiàn)表1。

注：“*”表示定量離子。

1.4 試驗(yàn)步驟

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取10.0 mg D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇定容至10 mL，得到1 000 μg/mL的D5-氨基甲酸乙酯儲(chǔ)備液，再逐級(jí)稀釋至1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液。準(zhǔn)確稱取10.0 mg氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇定容至10 mL，得到1 000 μg/mL的氨基甲酸乙酯儲(chǔ)備液，再逐級(jí)稀釋至1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別準(zhǔn)確吸取一定量氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)中間液，加入10 μL D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)中間液，用甲醇定容至1.0 mL，得到0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4.2 樣品前處理

將面包剪碎，-20 ℃密封冷凍2 h，取出后迅速破碎均勻，準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品于15 mL離心管中，加入25 μL D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)中間液(1 μg/mL)，然后加入10 mL 10 g/100 mL乙酸鉛溶液，渦旋，超聲10 min，離心，取4 mL上清液于Cleanert EC堿性硅藻土固相萃取柱中，在真空條件下，使樣品滲入固相萃取柱中，靜置10 min；用10 mL正己烷淋洗后，用20 mLV(乙酸乙酯)∶V(乙醚)=1∶10溶液洗脫，收集洗脫液，經(jīng)無(wú)水Na2SO4除水后，氮吹濃縮至約0.5 mL，用甲醇定容至1 mL，上機(jī)，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)比較了非極性柱VT-5MS、中等極性柱VT-35MS和極性柱VT-WAX對(duì)目標(biāo)分析物的分離效果。氨基甲酸乙酯具有較強(qiáng)極性，導(dǎo)致其在非極性柱VT-5MS和中等極性柱VT-35MS上分離效果不佳以及峰型較差；而在VT-WAX色譜柱上獲得較好的分離度和峰型。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.2.1 質(zhì)譜離子源選擇

由于氨基甲酸乙酯的相對(duì)分子質(zhì)量較小(89)，使用EI源進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，特征離子碎片不明顯，受背景干擾較為嚴(yán)重，靈敏度較低。CI源是一種軟化學(xué)電離源，選擇特異性強(qiáng)，能夠獲得準(zhǔn)確的分子離子，離子碎片較少，相對(duì)EI源具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、背景干擾小的特點(diǎn)。由于氨基甲酸乙酯具有堿性和親核的特性，可用PCI源進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)比較了面包基質(zhì)加標(biāo)樣品(氨基甲酸乙酯、D5-氨基甲酸乙酯的質(zhì)量濃度分別為10 μg/L、10 μg/L)在相同條件下，正化學(xué)源結(jié)合三重四極桿模式(positive chemical ionization-mass spectrometh/mass spectrometry,PCI-MS/MS)與硬電離源結(jié)合三重四極桿模式(electron ionization-mass spectrometry/mass spectrometry,EI-MS/MS)對(duì)氨基甲酸乙酯的檢測(cè)效果，見(jiàn)圖1。由圖1可得，在選擇PCI-MS/MS進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，氨基甲酸乙酯響應(yīng)更好，同時(shí)背景基線更低、雜峰干擾更少，因此本實(shí)驗(yàn)采用PCI源，在PCI-MS/MS模式下，以甲烷為反應(yīng)氣對(duì)氨基甲酸乙酯進(jìn)行分析。

2.2.2 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

在正化學(xué)電離源檢測(cè)模式下對(duì)氨基甲酸乙酯及D5-氨基甲酸乙酯進(jìn)行全掃描分析，在質(zhì)譜圖中選擇豐度較高、質(zhì)荷比較大的離子作為母離子；設(shè)定5～40 eV(每5 eV一個(gè)間隔)的碰撞能，對(duì)選定的母離子進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，根據(jù)產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖，選擇離子強(qiáng)度大的作為定量離子，離子強(qiáng)度次之的為定性離子，具體質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。圖2為使用優(yōu)化后條件采集氨基甲酸乙酯和D5-氨基甲酸乙酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖。

2.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.3.1 提取條件優(yōu)化

面包含油脂及蛋白質(zhì)較多，經(jīng)過(guò)破碎均勻后，用溶劑提取時(shí)易產(chǎn)生溶脹現(xiàn)象，形成黏稠狀勻漿。若在提取過(guò)程中不進(jìn)行蛋白沉淀，易導(dǎo)致提取不完全，凈化柱被堵塞，即使內(nèi)標(biāo)校正亦會(huì)出現(xiàn)回收率不穩(wěn)定及偏低等情況。一般情況下，需要先用沉淀劑進(jìn)行蛋白沉淀，再用提取溶劑進(jìn)行提取，但過(guò)程相對(duì)繁瑣且易導(dǎo)致目標(biāo)物損失。氨基甲酸乙酯具有較強(qiáng)極性，易溶于水，因此實(shí)驗(yàn)可采用含蛋白沉淀劑的水溶液進(jìn)行提取。乙酸鉛是典型的蛋白沉淀劑，在陰性面包樣品中添加氨基甲酸乙酯0.025 μg，比較10 mL的1、2、5、10、15、20 g/100 mL乙酸鉛水溶液作為提取溶劑的提取效果，平行試驗(yàn)6次，以氨基甲酸乙酯平均峰面積指示提取效果(定量離子對(duì)61.9/44.0峰面積計(jì))，結(jié)果見(jiàn)圖3。

結(jié)果表明，當(dāng)乙酸鉛質(zhì)量濃度≥10 g/100 mL時(shí),氨基甲酸乙酯峰面積趨于平緩，因此選用10 g/100 mL乙酸鉛溶液進(jìn)行提取。

2.3.2 凈化條件優(yōu)化

面包含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維等物質(zhì)，在提取過(guò)程中易形成共提取效應(yīng)，干擾目標(biāo)物檢測(cè)。同時(shí)，氨基甲酸乙酯本身分子量較小，形成的離子質(zhì)荷比較小，易受雜質(zhì)離子干擾。實(shí)驗(yàn)比較了Cleanert EC堿性硅藻土固相萃取柱和佛羅里硅土柱對(duì)樣品提取液的凈化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，弗羅里硅土柱吸附氨基甲酸乙酯的能力較差，回收率不佳，主要體現(xiàn)在目標(biāo)物損失大，理論加標(biāo)濃度在儀器上檢測(cè)信號(hào)較低；而Cleanert EC堿性硅藻土固相萃取柱對(duì)氨基甲酸乙酯有很強(qiáng)的吸附能力，淋洗雜質(zhì)后，反向洗脫目標(biāo)物質(zhì)，能夠得到較好回收率，氨基甲酸乙酯在儀器上的絕對(duì)響應(yīng)更高，回收率在90%左右，因此選擇Cleanert EC堿性硅藻土固相萃取柱。

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

經(jīng)氣相色譜-正化學(xué)源-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，以選擇離子對(duì)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行分析測(cè)定，以氨基甲酸乙酯質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，特征離子對(duì)的相對(duì)峰面積(D5-氨基甲酸乙酯為內(nèi)標(biāo)校正)為縱坐標(biāo)(Y)，作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。氨基甲酸乙酯在0.5～50.0 μg/L范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.999 5。方法檢出限以空白面包基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度出峰時(shí)，取信噪比S/N=3計(jì)算得出。定量限以空白面包基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度出峰時(shí)，取信噪比S/N=10計(jì)算得到。氨基甲酸乙酯線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限(limit of determination,LOD)、定量限(limit of quantitation,LOQ)詳見(jiàn)表2。

2.5 方法回收率和精密度

以面包陰性樣品為空白，分別添加2.0、10.0、50.0 μg/kg三個(gè)不同水平的氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)加入25 μL 1 μg/mL的D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)中間液，按照1.4.2進(jìn)行樣品前處理，經(jīng)GC-PCI-MS/MS分析。每個(gè)加標(biāo)濃度水平1 d內(nèi)平行測(cè)定6次，連續(xù)測(cè)定3 d，以當(dāng)天配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算加標(biāo)樣品的濃度，并計(jì)算回收率和日內(nèi)日間精密度(relative standard deviation,RSD)，結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可得出，面包中氨基甲酸乙酯的回收率在89.3%～95.6%之間，日內(nèi)RSD在1.3%～4.6%之間，日間RSD在4.5%～9.9%之間，表明該方法的準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好，通用性較強(qiáng)。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用本方法測(cè)定了30批次面包(編號(hào)為1～30)中的氨基甲酸乙酯含量。30批次面包中有26批次檢出氨基甲酸乙酯，檢出率86.7%，數(shù)值范圍在0.65～92.23 μg/kg之間，其中有檢出，但數(shù)值低于1 μg/kg的樣品有4批次，說(shuō)明該方法適用于氨基甲酸乙酯痕量分析，具體結(jié)果見(jiàn)表4。

注：ND表示未檢測(cè)到。

3 結(jié)論

本文比較了不同質(zhì)量濃度乙酸鉛溶液對(duì)面包基質(zhì)的蛋白沉淀效果及氨基甲酸乙酯提取效果，當(dāng)乙酸鉛質(zhì)量濃度達(dá)到10 g/100 mL時(shí)即可達(dá)到較好的蛋白沉淀效果及氨基甲酸乙酯提取效果；同時(shí)比較了氨基甲酸乙酯在PCI和EI兩種離子源檢測(cè)條件下的靈敏度及基質(zhì)干擾情況，其中氨基甲酸乙酯在PCI源檢測(cè)條件下靈敏度優(yōu)勢(shì)明顯，受基質(zhì)干擾更小。采用優(yōu)化后的GC-PCI-MS/MS方法，在空白面包樣品添加質(zhì)量濃度為2、10、50 μg/kg的范圍內(nèi)，氨基甲酸乙酯的回收率為89.3%～95.6%，日內(nèi)RSD為1.3%～4.6%，日間RSD為4.5%～9.9%，檢出限為0.12 μg/kg，比一般選擇EI源的檢測(cè)方法檢出限(1.0 μg/kg)低5倍以上，因此優(yōu)化后的方法選擇性強(qiáng)、靈敏度高、檢出限低、準(zhǔn)確度好，適用于面包中氨基甲酸乙酯痕量分析。