何芝菲

（重慶市潼南區(qū)疾病預(yù)防控制中心，重慶402660）

氯氰菊酯是一種擬除蟲菊酯類殺蟲劑，其殺蟲活性較高，對(duì)光和熱均比較穩(wěn)定，廣泛用于蔬菜、水果的殺蟲[1]。氯氰菊酯在環(huán)境中的半衰期長(zhǎng)，在自然條件下難以快速降解。因此大量長(zhǎng)期使用，必然會(huì)造成蔬菜、水果中氯氰菊酯殘留較高的情況[2]。盡管氯氰菊酯毒性相對(duì)較低，但食用殘留量較高的食品后會(huì)對(duì)人們的身體健康帶來巨大的威脅。近年來，隨著我國(guó)與西方國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易的發(fā)展，一些西方國(guó)家調(diào)整了農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的標(biāo)準(zhǔn)，造成我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品出口的標(biāo)準(zhǔn)更加嚴(yán)格。為解決這一問題，急需尋求一種安全有效的途徑來降解農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥的殘留[3]。

利用微生物來降解土壤中的農(nóng)藥是一種最主要、最徹底的凈化方式。而對(duì)農(nóng)藥有降解作用的微生物主要有細(xì)菌、放線菌、真菌等[4]?？莶菅挎邨U菌就具有降解能力，因此利用枯草芽孢桿菌降解土壤中農(nóng)藥技術(shù)研究具有十分重要的意義。生物修復(fù)方法是指利用生物本身或生物產(chǎn)品來降解污染物，此方法具有無毒、無殘留等優(yōu)點(diǎn)，其使用成本較低，且能有效消除農(nóng)藥殘留或者降低殘留農(nóng)藥毒性[5]。以生物修復(fù)（Bioremediation）為理論基礎(chǔ)的農(nóng)藥殘留降解菌技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)高效、無毒、無二次污染，而且經(jīng)濟(jì)實(shí)用，操作簡(jiǎn)單，是一種降解農(nóng)藥的重要方法[6]，目前國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)擬采用高效液相色譜法測(cè)定1株分離自重慶市潼南區(qū)某果園的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，編號(hào)A-1）對(duì)氯氰菊酯的降解率，為該菌的進(jìn)一步研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

A-1，分離自重慶市潼南區(qū)某果園的1株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），初篩表現(xiàn)出對(duì)氯氰菊酯有一定降解作用，現(xiàn)由重慶市潼南區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要儀器及試劑

LC-10A2010C HT液相色譜儀（日本島津公司），附LC-solution工作站（日本島津公司）；Satorius CP225D型電子天平（德國(guó)塞多利斯公司）；SORVALL pico型高速離心機(jī)（美國(guó)ABI公司）；Mill-Q超純水儀等（德國(guó)密理博公司）。

正己烷(華大)、丙酮(華大)、二氯甲烷(華大)、乙腈（TEDIA）、甲醇（TEDIA）等

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

將A-1劃線于（含氯氰菊酯100 mg/L）LB斜面，30 ℃培養(yǎng)24 h后，用無菌生理鹽水洗下并調(diào)整細(xì)胞濃度約為108個(gè)/mL，制成種子液。

將A-1種子液接種于100 mg/L氯氰菊酯的LB培養(yǎng)基中，接種量5%，分裝于30 mL/瓶。同時(shí)接種5%無菌水為空白對(duì)照，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)120 h，測(cè)定A-1對(duì)氯氰菊酯的降解情況。

1.3.2 氯氰菊酯的提取與降解率測(cè)定

取1 mL均勻培養(yǎng)液，加入1 mL乙腈，超聲波破碎30 min，用乙腈定容至10 mL，于13 000r /min離心10 min，將上清液用0.45μm的有機(jī)相濾膜過濾，棄初濾液，取續(xù)濾液供液相色譜分析用。測(cè)定條件：色譜柱為Gemini 100? C18柱（5.0 μm，150 mm×4.60 mm）；流動(dòng)相為乙腈-水（76∶24，v/v），流速1.0 mL/min；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為210 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

A-1在1.3.1條件下經(jīng)120 h培養(yǎng)，除去對(duì)照組氯氰菊酯的損失部分，采用歸一法進(jìn)行計(jì)算，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出空白對(duì)照中農(nóng)藥含量為7.24%，樣品液中殘留農(nóng)藥含量為5.05%。依據(jù)降解率計(jì)算公式得出實(shí)驗(yàn)組中30.25%氯氰菊酯被A-1降解（圖1）。說明此株菌對(duì)氯氰菊酯具有降解能力，A-1對(duì)氯氰菊酯降解率為30.25%。

3 結(jié)論與討論

圖1 A-1的氯氰菊酯的液相色譜圖

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）可降解的農(nóng)藥類型較多，如有機(jī)磷、有機(jī)氯等殺蟲劑、甲磺隆等除草劑。但是國(guó)內(nèi)對(duì)于枯草芽孢桿菌對(duì)氯氰菊酯的研究較少，因此還有很大的后續(xù)研究空間。枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌中具有較大應(yīng)用潛力的菌種之一，枯草芽孢桿菌可作為微生物農(nóng)藥，在抑制植物病原菌生物防治領(lǐng)域也有良好的作用?？莶菅挎邨U菌作為植物生防細(xì)菌之一，具有較強(qiáng)的防病作用。雖然A-1已被證實(shí)對(duì)氯氰菊酯具有一定的降解的能力，但要將其用于制備微生物制劑還必須對(duì)其進(jìn)行一系列的生理學(xué)特征的鑒定以及其他相關(guān)研究。除此之外，還應(yīng)對(duì)A-1用小白鼠進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)，從而保證安全性。

如果經(jīng)過以上各項(xiàng)試驗(yàn)后，表現(xiàn)出良好的降解能力且無毒，則可以考慮將其作為微生態(tài)制劑的候選菌種開發(fā)。隨著微生態(tài)制劑的發(fā)展及其研究的不斷深入，將來多種微生物復(fù)合的微生態(tài)制劑研究將向高技術(shù)、高產(chǎn)量、高質(zhì)量方向發(fā)展，具有廣泛的市場(chǎng)空間。目前對(duì)于枯草芽孢桿菌降解氯氰菊酯的報(bào)道較少，對(duì)此的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。本實(shí)驗(yàn)中的菌株可以進(jìn)行動(dòng)物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究該菌株是否為益生菌，如何將枯草芽孢桿菌制成生物制劑并廣泛應(yīng)用，枯草芽孢桿菌中酶提取以及枯草芽孢桿菌在表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用等，都是需要在未來進(jìn)一步研究的問題。