李 攀，薛敏華，唐 婉，石蓓佳，杭太俊，陸益紅**

1 中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析系，南京 210009；2 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 210019；3 徐州醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室，徐州 221004

開展仿制藥一致性評(píng)價(jià)，保障仿制藥在質(zhì)量和療效上與原研藥一致，在臨床上實(shí)現(xiàn)與原研藥相互替代，不僅可以節(jié)約醫(yī)療費(fèi)用，也有助于提升我國(guó)仿制藥質(zhì)量和制藥行業(yè)的整體發(fā)展水平，保證公眾用藥安全有效。仿制藥能替代原研藥在臨床上使用的前提，是仿制制劑與指定的參比制劑藥學(xué)等效（Pharmaceutical equivalence，PE）和生物等效（bioequivalence，BE），以此證明仿制制劑具有與參比制劑相同的質(zhì)量和療效。對(duì)于固體口服制劑PE 的重要組成部分是考察仿制藥和原研藥在多種不同pH溶出介質(zhì)中的溶出行為的相似性，這是對(duì)口服固體制劑內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)的最主要方法。然而，體外溶出曲線相似性評(píng)價(jià)僅模擬表征了藥物在胃腸道中的釋放和溶解過程，雖然可以提高仿制藥生物等效的可能性，卻難以準(zhǔn)確地表征藥物在體內(nèi)的真實(shí)過程，因此，需要進(jìn)行BE 研究以確保仿制藥與原研藥療效的一致性。

軟件模擬被廣泛地應(yīng)用于藥物體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的研究[1]，它可以為體內(nèi)外相關(guān)性研究、BE 試驗(yàn)的設(shè)計(jì)提供幫助。本文采用的GastroPlusTM軟件內(nèi)置了獨(dú)有的高級(jí)房室吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)模型（advanced compartmental absorption and transit model，ACAT），它按生理學(xué)特征將胃腸道分為9 個(gè)房室，考慮了藥物在胃腸道中的6 種狀態(tài)，可以構(gòu)建藥物特異性胃腸道吸收模型[2，3]。其基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)（physiologically based pharmacokinetic，PBPK）模型考慮了解剖學(xué)和生理學(xué)以及藥物和制劑的物理化學(xué)性質(zhì)，描述了藥物吸收、分布、代謝和排泄的動(dòng)力學(xué)過程[4，5]。將藥物的理化性質(zhì)參數(shù)輸入到ACAT 模型用于表征藥物的胃腸道吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，建立藥物的PBPK 模型用于表征藥物的處置過程，將藥物的體外溶出曲線導(dǎo)入到軟件中，以評(píng)估制劑的溶出行為對(duì)藥物體內(nèi)過程的影響；因此，結(jié)合體外溶出曲線相似性評(píng)價(jià)，同時(shí)采用計(jì)算機(jī)軟件模擬技術(shù)的建模，可以模擬藥物在體內(nèi)的過程[6]。

瑞舒伐他汀鈣（Rosuvastatin Calcium）為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，由日本鹽野義制藥株式會(huì)社于20 世紀(jì)80 年代末合成，后由英國(guó)阿斯利康公司開發(fā)研制，臨床用于調(diào)節(jié)血脂。國(guó)內(nèi)已有多個(gè)廠家對(duì)瑞舒伐他汀鈣片進(jìn)行仿制[7-9]。從體外溶出曲線研究和體內(nèi)生物等效性評(píng)價(jià)兩個(gè)方面系統(tǒng)評(píng)價(jià)國(guó)產(chǎn)瑞舒伐他汀鈣片，關(guān)于這方面的研究，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)合瑞舒伐他汀鈣的BCS 特性，使用體外溶出曲線和GastroplusTM評(píng)估瑞舒伐他汀鈣片國(guó)產(chǎn)仿制制劑與參比制劑的生物等效性，并與臨床試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，驗(yàn)證模擬BE 的可行性，以及軟件評(píng)估的可靠性，為仿制藥的一致性評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Sciex API 5000 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（配有ESI源及Analyst 定量處理軟件，美國(guó)Sciex 公司）；島津LC20 高相液相色譜儀（SPD-M20A，日本Shimadzu公司）；AT7 smart 自動(dòng)溶出儀（瑞士Sotax 公司）；ZKT-18F 真空脫氣機(jī)（天津天大天發(fā)科技有限公司）；XSE205 十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Seven Excellence 多參數(shù)測(cè)定儀（瑞士梅特勒-托利多公司）；0.45 μm 針頭濾膜（PES 和尼龍，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

GastroPlusTM（版本9.5.0004，Simulations Plus，Inc.，Lancaster，CA，USA）。

1.2 藥品與試劑

參比制劑（R）瑞舒伐他汀鈣片（規(guī)格10 mg，批號(hào)131343、131347、131358，AstraZeneca UK Limited 公司）；仿制制劑（T）（規(guī)格10 mg，批號(hào)171701、170702、170703，A 制藥公司）；瑞舒伐他汀鈣對(duì)照品（純度97.6%，批號(hào)101028-201202，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；瑞舒伐他汀鈣-d6（純度98.65%，批號(hào)2-WEN-131-1，加拿大TRC 公司）。

鹽酸、氫氧化鈉、檸檬酸三鈉二水合物、檸檬酸一水合物、乙酸鈉、冰醋酸、磷酸均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，德國(guó)Merck KGaA 公司）；甲酸（色譜純，美國(guó)Anaqua Chemical 公司）；溶出介質(zhì)試驗(yàn)用水：超純水，均采用脫氣裝置經(jīng)40 ℃脫氣30 min 后立即使用。

2 方法

2.1 體外溶出曲線相似性評(píng)價(jià)

2.1.1 pH-溶解度曲線的測(cè)定 將過量的瑞舒伐他汀鈣分別加入pH 值為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的緩沖液中，在37 ℃振搖24 h，使成飽和溶液，濾過，取續(xù)濾液適量，用25%乙腈適宜倍數(shù)稀釋后采用HPLC 法[10]測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算溶液中瑞舒伐他汀的含量，從而確定在不同pH 值緩沖液中瑞舒伐他汀的飽和溶解度。當(dāng)釋放介質(zhì)的體積為藥物飽和溶液所需介質(zhì)體積的至少3 倍量時(shí)，認(rèn)為滿足漏槽條件[11]，可作為體外溶出相似性評(píng)價(jià)的介質(zhì)。

2.1.2 體外溶出測(cè)試 比較進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)（JX20030283）[12]，瑞舒伐他汀鈣片的溶出度檢查項(xiàng)下溶出介質(zhì)（pH 6.6 枸櫞酸鹽緩沖液）、健康人體胃中生理液pH（0.1 mol·L-1鹽酸溶液）以及“普通口服固體制劑溶出曲線測(cè)定與比較指導(dǎo)原則”[10]推薦的溶出介質(zhì)（pH 4.5）。參照“普通口服固體制劑溶出度試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則”[13]，最終選擇0.1 mol·L-1鹽酸（pH 1.0）、pH 4.5 醋酸鹽緩沖液、pH 6.6 枸櫞酸鹽緩沖液作為溶出介質(zhì)，對(duì)兩制劑進(jìn)行溶出曲線研究。

取仿制制劑（T）和參比制劑（R）各3 批（n=12），照溶出度與釋放度測(cè)定法（《中國(guó)藥典》2015 年版通則0931 第二法）分別以3 種介質(zhì)900 mL 為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為50 r·min-1，依法操作，在5、10、20、30、45、60 min 時(shí)，分別取樣10 mL 并及時(shí)補(bǔ)液。將取出的溶液濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；另精密稱取瑞舒伐他汀鈣對(duì)照品適量，加溶出介質(zhì)并定量稀釋制成每毫升中約含10 μg 的溶液作為對(duì)照品溶液，參照瑞舒伐他汀鈣片進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)（JX20030283）[12]溶出度項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，色譜條件為：

色譜柱：Waters X-Bridge C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：磷酸-水-乙腈（1∶600∶400）；檢測(cè)波長(zhǎng)：242 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。典型色譜圖如圖1 所示。

圖1 體外溶出測(cè)試典型色譜圖

2.1.3 數(shù)據(jù)分析 當(dāng)仿制制劑和參比制劑在15 min時(shí)的平均溶出量均不低于85%時(shí)，認(rèn)為兩者的溶出曲線相似；否則，用相似因子（f2）法比較溶出曲線相似性[14]。當(dāng)f2值不小于50 時(shí)，認(rèn)為兩條溶出曲線相似，否則認(rèn)為不相似[14，15]。以下等式定義f2：

其中Rt和Tt表示在時(shí)間點(diǎn)（t）的參比和仿制制劑的平均溶出百分?jǐn)?shù)，n 是比較平均溶出時(shí)間點(diǎn)的數(shù)量。

2.2 體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

2.2.1 研究對(duì)象 依據(jù)CFDA 最新頒布的“生物等效性指南”對(duì)生物等效性試驗(yàn)入組受試者性別的建議：研究將擬用于兩種性別的人群；且FDA 關(guān)于瑞舒伐他汀鈣的Clinical Pharmacology Biopharmaceutics Review 中一則生物等效性試驗(yàn)所用受試者例數(shù)為31 例，另一則為32 例。參考以上情況，試驗(yàn)擬入組30 例健康受試者，實(shí)際入組28 例，男性18例，女性10 例，20～43 周歲，體重不低于50 kg，體重指數(shù)（BMI）在19.0～26.0 kg·m-1，無吸煙、嗜酒史，全面體檢各項(xiàng)指標(biāo)均正常。

受試者試驗(yàn)開始前3 個(gè)月內(nèi)未參加其它任何藥物臨床試驗(yàn)，且6 周內(nèi)未服用任何藥物。受試者本人簽署知情同意書，并經(jīng)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院人體研究倫理委員會(huì)審批同意。

受試者隨機(jī)分為2 組，禁食10～12 h 后，空腹口服仿制制劑（批號(hào)170701）或參比制劑（批號(hào)131343）1 片，用250 mL 溫開水吞服藥物，受試者口服藥物前0 h（服藥前0.5 h 內(nèi)）和服藥后0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0、16.0、24.0、36.0、48.0、72.0 h 分別于肘靜脈取血約2.5 mL，分別置于含EDTA-2K 抗凝試管中，試管提前置于冰上預(yù)冷。4 ℃、3 000 r·min-1離心10 min。吸取上層血漿，-80 ℃保存，供血藥濃度測(cè)定用。

2.2.2 分析方法 以瑞舒伐他汀鈣-d6作為內(nèi)標(biāo)，100 μL 血漿樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白，采用經(jīng)過驗(yàn)證的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法檢測(cè)血漿樣本中瑞舒伐他汀的濃度。

色譜條件：色譜柱：SunFireTMC18（2.1mm×50mm，3.5 μm）；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，B：0.1%甲酸乙腈溶液[梯度：0～2 min（35%B～70%B）；2.05～3.50 min（95%B～95%B）；3.55～5 min（35%B～35%B）]；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

質(zhì)譜條件：采用大氣壓電噴霧離子源（ESI+）；正離子模式，選擇多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM），用于定量的離子反應(yīng)為：瑞舒伐他汀選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)：m/z 482.2→m/z 258.2，瑞舒伐他汀-d6選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)：m/z 488.2→m/z 264.2。

2.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 使用Phoenix WinNonlin Version 7.0 以非房室模型進(jìn)行PK 分析，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)包括：Cmax、AUC0-t、AUC0-∞、Tmax。使用SAS Version 9.2 對(duì)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0-t、AUC0-∞經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析及雙單側(cè)t 檢驗(yàn)，并計(jì)算90%置信區(qū)間，考察仿制制劑與參比制劑的生物等效性，如果Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的幾何平均比（仿制/參比）的90%置信區(qū)間在80.00%～125.00%，則認(rèn)為兩制劑生物等效[16]。相對(duì)生物利用度的計(jì)算公式為

（AUC0-t）T 為仿制制劑的AUC0-t，（AUC0-t）R 為參比制劑的AUC0-t。

2.3 群體藥代動(dòng)力學(xué)模擬

利用GastroPlusTM模擬軟件構(gòu)建虛擬群體（n=28，20～50 歲，健康中國(guó)人，男性和女性均50%）模擬單次口服每種瑞舒伐他汀鈣片的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。模型建立參數(shù)見表1。計(jì)算每個(gè)虛擬受試者的Cmax、Tmax、AUC0-∞和AUC0-t。報(bào)告中位數(shù)和直接采用5%和95%的結(jié)果表示90%的置信區(qū)間。

表1 模型建立參數(shù)收集

3 結(jié)果

3.1 pH-溶解度曲線的測(cè)定

瑞舒伐他汀鈣在不同pH 緩沖液中的溶解度曲線見圖2。隨著pH 增加，溶解度先上升后下降。藥物在各種pH 條件下的溶解度均大于0.041 7 mg·mL-1（以瑞舒伐他汀10 mg 計(jì)），滿足漏槽條件，各介質(zhì)均可作為瑞舒伐他汀鈣片的溶出介質(zhì)。

圖2 瑞舒伐他汀鈣在不同pH 緩沖液中的溶解度曲線

圖3 兩種瑞舒伐他汀鈣片在3 種溶出介質(zhì)中的溶出曲線

3.2 體外溶出測(cè)試

仿制制劑（T）和參比制劑（R）在3 種溶出介質(zhì)中的溶出曲線如圖3 所示。數(shù)據(jù)表示為±s（n=12）。

3.2.1 鹽酸（pH 1.0）溶液中的溶出曲線相似性評(píng)價(jià)3 批參比制劑在15 min 時(shí)的平均累積溶出量均大于85%，3 批仿制制劑在15 min 時(shí)的平均累積溶出量小于85%（圖3-A），因此計(jì)算f2因子評(píng)價(jià)仿制制劑與參比制劑體外溶出相似性。除仿制品批號(hào)170703 的f2因子為49，其他2 個(gè)仿制品批號(hào)的f2因子均大于50（見表2），認(rèn)為仿制制劑與參比制劑在該介質(zhì)中的體外溶出曲線基本相似。

表2 在pH 1.0 溶出介質(zhì)中的f2因子計(jì)算結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3.2.2 醋酸鹽緩沖液（pH 4.5）中的溶出曲線相似性評(píng)價(jià) 3 批參比制劑在15 min 時(shí)的平均累積溶出量均小于85%，仿制制劑均不低于85%（圖3-B）。經(jīng)計(jì)算f2因子均小于50（見表3），說明仿制制劑與參比制劑的體外溶出曲線不相似。

表3 在pH 4.5 的溶出介質(zhì)中的f2因子計(jì)算結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3.2.3 枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.6）中的溶出曲線相似性評(píng)價(jià) 雖然參比制劑的溶出速率較仿制制劑稍慢，但15 min 幾乎完全溶出（＞85%）（見圖3-C）。仿制制劑與參比制劑的體外溶出曲線相似。

3.3 體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

28 例健康受試者單次口服瑞舒伐他汀鈣片10 mg，仿制制劑和參比制劑平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖4，兩者變化趨勢(shì)基本一致。生物等效性分析結(jié)果見表4，仿制制劑的相對(duì)生物利用度F 為95.65%±17.62%（AUC0-t）。Cmax的幾何均值比的90%CI 為84.09%～104.70%，AUC0-t的幾何均值比的90%CI 為88.32%～103.58%，AUC0-∞的幾何均值比的90%CI 為94.17%～105.28%，均在80%～125%的范圍內(nèi)，兩制劑無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有生物等效性。

圖4 28 名健康志愿者單次口服瑞舒伐他汀鈣片受試制劑（T）和參比制劑（R）10 mg 后的平均藥物濃度-時(shí)間曲線（±s）

表4 生物等效性研究參數(shù)統(tǒng)計(jì)

3.4 群體藥代動(dòng)力學(xué)模擬

圖5 顯示了參比制劑和仿制制劑在虛擬的28名健康成年中國(guó)人中的群體藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果，點(diǎn)代表實(shí)測(cè)的平均血藥濃度，線代表預(yù)測(cè)的平均血藥濃度。兩制劑藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值見表5。主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Cmax和AUC 的預(yù)測(cè)誤差（%PE）不大于10%；Tmax的%PE 稍高，但小于20%，且參比制劑說明書報(bào)告了單次口服10 mg 瑞舒伐他汀鈣片后Tmax的中位值為2.5～5 h，模擬值分別為3.24（R）和3.25（T），仍可接受[17]。

綜上，認(rèn)為GastroPlusTM建立的群體藥代動(dòng)力學(xué)模型較為合理的描述了單次口服瑞舒伐他汀鈣片的藥代動(dòng)力學(xué)特征。虛擬BE 結(jié)果顯示Cmax的幾何均值比（T/R）的90%CI 為86.44%～112.44%，AUC0-t的幾何均值比的90%CI 為91.36%～118.80%，AUC0-∞的幾何均值比的90%CI 為91.35%～118.80%，均在80%～125%的范圍內(nèi)，兩制劑具有生物等效性。

圖5 參比制劑（R）和仿制制劑（T）虛擬模擬28 個(gè)健康成年中國(guó)人PK 曲線

表5 口服不同瑞舒伐他汀鈣片藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果（±s）

表5 口服不同瑞舒伐他汀鈣片藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果（±s）

*%PE=（模擬值-實(shí)測(cè)值）/實(shí)測(cè)值×100%

4 討論

瑞舒伐他汀鈣在pH 1.0 鹽酸溶液中不穩(wěn)定，降解產(chǎn)生雜質(zhì)B、D 及少量未知雜質(zhì)，在此介質(zhì)中的溶出曲線，均以主峰和酸降解產(chǎn)物的峰面積和計(jì)算[18]。經(jīng)試驗(yàn)考察，雜質(zhì)B 的相對(duì)校正因子為1.0，雜質(zhì)D為0.9，在0.9～1.1 范圍內(nèi)，且仿制藥和參比制劑降解程度差異不大（見表6）。因此，采用上述文獻(xiàn)方法計(jì)算瑞舒伐他汀鈣在pH 1.0 鹽酸溶液中的溶出曲線，更科學(xué)合理。在pH 4.5 醋酸鹽緩沖液中，仿制制劑與參比制劑的溶出曲線不相似，原因可能是參比制劑中含有堿性輔料磷酸鈣，對(duì)制劑溶出有所影響。虛擬BE 試驗(yàn)和臨床BE 試驗(yàn)結(jié)果均表明仿制制劑與參比制劑生物等效，且仿制制劑已通過一致性評(píng)價(jià)。綜上認(rèn)為，仿制制劑在pH 4.5 的醋酸鹽緩沖液中的溶出速率與參比制劑不相似，對(duì)藥物的體內(nèi)PK 影響不大，僅僅通過體外溶出曲線相似性評(píng)價(jià)不能準(zhǔn)確反映瑞舒伐他汀鈣片的體內(nèi)過程。

參比制劑在pH 1.0 的鹽酸溶液中的溶出速率快于仿制制劑，而在pH 4.5 和pH 6.6 的介質(zhì)中的溶出速率慢于仿制制劑，可能是由于仿制制劑的包衣層與輔料及生產(chǎn)工藝與參比制劑不一致導(dǎo)致的。由于臨床BE 試驗(yàn)結(jié)果顯示兩制劑各PK 參數(shù)不存在顯著差異，說明制劑經(jīng)胃腸道到達(dá)吸收部位時(shí)，藥物已基本完全溶出，溶出速率的差異被均一化。

表6 兩制劑在pH 1.0 鹽酸溶液中降解情況統(tǒng)計(jì)

對(duì)比實(shí)測(cè)的和模擬的藥代動(dòng)力學(xué)曲線，軟件在吸收相擬合良好；在消除相，模擬比實(shí)測(cè)的消除稍慢，可能是由于模型建立所用的清除率和分布容積等數(shù)據(jù)是基于白種人的靜脈滴注數(shù)據(jù)計(jì)算得到，與中國(guó)人存在差異導(dǎo)致的。盡管虛擬BE 和實(shí)際臨床試驗(yàn)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)存在一定差異，但結(jié)果均顯示仿制品與參比品生物等效。虛擬BE 試驗(yàn)為仿制藥一致性評(píng)價(jià)工作的臨床前研究提供了一種新的思路，即體外-PK 建模-體內(nèi)研究。為制劑處方篩選和BE臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)，降低制劑生物不等效風(fēng)險(xiǎn)，縮短藥物的研發(fā)周期。GastroPlusTM等計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)可用于仿制藥一致性評(píng)價(jià)研究中。