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工程大腸桿菌異源表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的誘導(dǎo)工藝研究

2020-01-03 09:35:04超陳博李義45佟毅45
發(fā)酵科技通訊 2019年4期
關(guān)鍵詞:工程菌誘導(dǎo)劑發(fā)酵罐

彭 超陳 博李 義45佟 毅45

(1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司,北京102209;2.營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102209;3.老年營養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室,北京 102209;4.中糧生物科技股份有限公司,安徽 蚌埠 233010;5.玉米深加工國家工程研究中心,吉林 長春 130033)

D-阿洛酮糖是D-果糖在C-3的差向異構(gòu)體,是自然界中存在含量極少的一種稀有單糖,具有極低的熱量值,與蔗糖甜度相似,但吸收率僅為蔗糖的0.3%,故可以替代蔗糖作為低熱甜味劑,而且研究表明D-阿洛酮糖具有多種營養(yǎng)學(xué)和生理學(xué)功能[1-3]。但是,D-阿洛酮糖的化學(xué)合成比較困難,以鉬酸鹽為催化劑,反應(yīng)溫度維持在80~120 ℃,過程副產(chǎn)物較多[4],目前尚未有突破性進(jìn)展。生物轉(zhuǎn)化方法單一,純化步驟簡單,受到科研人員的重點(diǎn)關(guān)注,利用微生物途徑和酶催化轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D-阿洛酮糖是目前的主流研究方向,而DPEase酶可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化,利用D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖[5-6]。

筆者以中糧營養(yǎng)健康研究院構(gòu)建的高效表達(dá)DPEase酶的工程大腸桿菌為研究對象,在5 L發(fā)酵罐中考察誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)pH和誘導(dǎo)劑用量對大腸桿菌生長和蛋白酶表達(dá)的影響,確定了大腸桿菌異源表達(dá)DPEase酶的較優(yōu)誘導(dǎo)條件,為進(jìn)一步研究D-阿洛酮糖的生物轉(zhuǎn)化提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 菌 株

工程大腸桿菌NHRI-Ec01,中糧營養(yǎng)健康研究院實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏,卡那霉素抗性。

1.2 菌種培養(yǎng)基

種子培養(yǎng):蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,氯化鈉10 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基:磷酸二氫鉀9 g/L,磷酸氫二銨4 g/L,無水檸檬酸1.7 g/L,酵母粉5 g/L,葡萄糖20 g/L,七水硫酸鎂0.6 g/L,維生素B1 0.004 5 g/L,消泡劑0.1 g/L,微量元素1 mL/L,25%氨水溶液調(diào)節(jié)pH至7.0±0.1。

微量元素:EDTA 0.72 g/L,六水氯化鈷0.25 g/L,四水氯化錳1.5 g/L,五水硫酸銅0.22 g/L,硼酸0.3 g/L,鉬酸銨0.182 g/L,硫酸鋅1.7 g/L,五水檸檬酸鐵銨17.58 g/L,濃硫酸1 mL,去離子水1 L。按配方配好后在超凈臺用0.22 μm無菌過濾膜過濾,裝入無菌棕色瓶避光4 ℃保存。

補(bǔ)料培養(yǎng)基:葡萄糖600 g/L,無水檸檬酸15 g/L,七水硫酸鎂2 g/L。

1.3 儀器與設(shè)備

Y-1200型可見分光光度計,上海美譜達(dá)儀器有限公司;SW-CJ-1FD潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;Milli-Q超純水儀,美國密理博有限公司;ZQZY-CF8振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司;1-14小型臺式離心機(jī),Sigma;1260 infinity高效液相色譜儀,Agilent Technologies;SBA-40E生物傳感分析儀,山東省科學(xué)院生物研究所;BioFlo 115發(fā)酵罐,New Brunswick;LX-600冷卻水循環(huán)裝置,YKKY;750-30無油空氣壓縮機(jī),上海捷豹壓縮機(jī)制造有限公司。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 種子培養(yǎng)

工程大腸桿菌NHRI-Ec01的甘油管菌種保藏于-80 ℃冰箱內(nèi)待用。取甘油管內(nèi)200 μL菌懸液接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,30 ℃,200 r/min條件下在恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16~17 h后得一級種子液,種子液OD600達(dá)到3.0以上。

1.4.2 發(fā)酵罐發(fā)酵

新鮮種子液按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入滅菌并冷卻后的5 L發(fā)酵罐中,培養(yǎng)液的初始體積為3 L,卡那霉素抗性加至質(zhì)量終濃度為50 μg/mL。初始培養(yǎng)溫度為37 ℃,初始通氣比為1 m3/(m3·min),25%氨水調(diào)節(jié)pH在6.8~7.2,初始糖耗盡后,采用補(bǔ)料-溶氧聯(lián)動方式控制補(bǔ)料培養(yǎng)基流加速率,使得發(fā)酵液中殘?zhí)呛亢愣ňS持在較低水平(小于1.0 g/L),溶氧(Dissolved oxygen,DO)與轉(zhuǎn)速級聯(lián),并控制DO在25%左右,發(fā)酵液OD600達(dá)到一定水平后,調(diào)整發(fā)酵溫度和pH至不同水平,添加一定量的誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.5 檢測方法

1.5.1 菌體量測定

將發(fā)酵液按照一定倍數(shù)稀釋,直至在600 nm波長處的吸光值介于0.3~0.7,測量600 nm下的吸光值,乘以稀釋倍數(shù)即為菌體量(OD600)。

1.5.2 殘?zhí)菧y定

取新鮮均一發(fā)酵液,以12 000 r/min高速離心,收集上清液,稀釋至可檢測范圍,SBA-40E型生物傳感器進(jìn)行分析檢測。

1.5.3 DPEase酶濃度測定

安捷倫HPLC 1260化學(xué)工作站,色譜柱為waters sugar-Pak I,規(guī)格為10 μm ×6.5 mm×300 mm,示差折光檢測器RID,檢測器溫度55 ℃,進(jìn)樣量10 μL,以脫氣超純水作流動相,流速為0.4 mL/min,柱溫為85 ℃。

樣品的測定:發(fā)酵液離心收集菌體后,無菌生理鹽水重懸至OD600值為100,60 MPa壓力下均質(zhì)機(jī)處理2~3次,細(xì)胞破碎液經(jīng)離心得到澄清酶液。新鮮酶液經(jīng)稀釋后,與30%質(zhì)量濃度的果糖葡萄糖混合液按體積比1∶20混合,55 ℃條件下反應(yīng)5 min。反應(yīng)后的樣品在100 ℃條件下高溫煮10 min以終止酶反應(yīng)。酶反應(yīng)產(chǎn)物低溫離心,上清液用0.22 μm微濾膜過濾處理,稀釋后進(jìn)行HPLC檢測。

假設(shè)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=AX+B,Y為峰面積,由液相檢測可得,A和B分別代表標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距,X為D-果糖濃度,由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計算可得。平衡轉(zhuǎn)化率計算公式為

式中:X1為各樣品的D-果糖濃度;X2為空白對照的果糖濃度。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果分析

2.1 工程大腸桿菌NHRI-Ec01的生長曲線測定

按1.4.2描述的方法進(jìn)行5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)(未誘導(dǎo)無補(bǔ)料),每隔2~4 h取樣測定OD600,并繪制出NHRI-Ec01菌株在5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)的生長曲線如圖1所示。

圖1 工程菌在5 L發(fā)酵罐中生長曲線Fig.1 The growth curve of engineering bacteria NHRI-Ec01 in 5 L bioreactor

由圖1可知:培養(yǎng)6 h,菌體生長進(jìn)入指數(shù)期(OD600為3.59),16 h進(jìn)入穩(wěn)定期(OD600維持在35~37)。若進(jìn)一步延長周期,菌體會因?yàn)闋I養(yǎng)缺陷而進(jìn)入衰亡期。指數(shù)生長期中期,菌體生長最為活躍,對外界環(huán)境最為敏感[7-8],因此將指數(shù)生長期中期(6~12 h)作為NHRI-Ec01菌株的最佳誘導(dǎo)時機(jī)。

2.2 誘導(dǎo)溫度對工程菌生長和DPEase酶平衡轉(zhuǎn)化率的影響

異源蛋白的表達(dá)很大程度上會增加宿主菌株的負(fù)擔(dān),影響自需蛋白的正常表達(dá),蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的正確折疊才是功能蛋白的合成基礎(chǔ)。通過降溫處理,可減緩多肽合成速率,為肽鏈正確空間折疊預(yù)留充足時間,避免形成無生物活性的包涵體結(jié)構(gòu)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)按照1.4.2描述的方法進(jìn)行5 L發(fā)酵培養(yǎng),初始溫度固定37 ℃,從指數(shù)期中期開始,培養(yǎng)溫度分別降至30,25,20 ℃,待溫度穩(wěn)定后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo),以考察誘導(dǎo)溫度對工程菌生長和DPEase酶表達(dá)的影響。發(fā)酵結(jié)果及酶活轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)如圖2,3所示。

圖2 誘導(dǎo)溫度對工程大腸桿菌生長的影響Fig.2 Effect of induction temperature on biomass growth and DPEase conversion rate

圖3 誘導(dǎo)溫度對DPEase酶平衡轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of induction temperature on DPEase conversion rate

由圖2可知:菌種活力旺盛,接種量合理,沒有明顯的延滯期,發(fā)酵6 h生長曲線已經(jīng)達(dá)到指數(shù)中期,分別降溫至不同水平并誘導(dǎo)后,菌體生長速率不同程度受影響,其中20 ℃誘導(dǎo)后的菌體生長速度影響最小,最高菌體OD600為62,可能是因?yàn)楫愒吹鞍渍_折疊,菌體負(fù)載壓力變化不大,而繼續(xù)保持較高溫度,形成包涵體沉淀的蛋白越多(蛋白膠圖未提供),不可溶性錯誤蛋白的積累不利于菌體生長,誘導(dǎo)18 h后發(fā)酵結(jié)束。

由圖3可知:低溫誘導(dǎo)表達(dá)的DPEase酶平衡轉(zhuǎn)化率最高,接近24%,盡管離文獻(xiàn)報道的最大轉(zhuǎn)化率64%相差甚遠(yuǎn)[11],但基本可以證明低溫誘導(dǎo)的優(yōu)越性。另外,低溫發(fā)酵往往會增加冷卻機(jī)組的能耗,加重企業(yè)運(yùn)行成本,而圖3同樣揭示了不同溫度誘導(dǎo)后的平衡轉(zhuǎn)化率差異不大?;诖耍摴こ叹淖罴颜T導(dǎo)溫度可以因季節(jié)和區(qū)域的不同,選定20~30 ℃比較適宜。

2.3 pH對工程菌生長和DPEase酶平衡轉(zhuǎn)化率的影響

蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)同樣受外界環(huán)境pH的影響。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是正確翻譯的氨基酸序列,序列中酸性氨基酸和堿性氨基酸的數(shù)量不同,影響到肽鏈或者蛋白質(zhì)的等電點(diǎn);同時,維持蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)的氫鍵和靜電作用也受環(huán)境pH的影響[12-13]。本實(shí)驗(yàn)按照1.4.2描述的方法進(jìn)行5 L發(fā)酵培養(yǎng),初始pH 7.0,培養(yǎng)至指數(shù)中期后降溫至25 ℃,并分別調(diào)整pH為6.6,7.0,7.4,待溫度和pH穩(wěn)定后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo),誘導(dǎo)時長超過18 h,以考察不同誘導(dǎo)pH對工程菌生長和DPEase酶表達(dá)的影響。發(fā)酵結(jié)果及酶活轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)如圖4,5所示。

圖4 誘導(dǎo)pH對工程菌生長的影響Fig.4 Effect of induction pH level on biomass growth

圖5 誘導(dǎo)pH對不同時間點(diǎn)相應(yīng)DPEase酶的平衡轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of induction pH level on DPEase conversion rate at different time

圖4,5分別了揭示了誘導(dǎo)pH對該工程菌生長和DPEase酶活性的影響。由圖4,5可知:誘導(dǎo)之前,發(fā)酵罐之間的生長平行性良好,降溫調(diào)pH后,相對來說,堿性環(huán)境對生長的影響較為明顯,穩(wěn)定平臺期的生物量比其他兩組低16%~19%,推斷是過量氨水中和了中間代謝有機(jī)酸,對有機(jī)酸的傳遞與供應(yīng)產(chǎn)生了競爭抑制??刂苝H為6.6時,發(fā)酵穩(wěn)定平臺期的OD600比pH 7.0方案稍高,說明該改造菌株適應(yīng)于中性和偏酸性環(huán)境,與文獻(xiàn)報道的工程大腸桿菌異源表達(dá)類人膠原蛋白生長最適pH接近[14]。

對于DPEase酶的表達(dá),發(fā)酵終點(diǎn)DPEase酶的平衡轉(zhuǎn)化率受pH影響變化不大,均在28%左右,但是相對于其他2組,pH 7.0恒定方案在發(fā)酵周期控制上有明顯優(yōu)勢,在誘導(dǎo)12 h、發(fā)酵18 h就可以達(dá)到最高的平衡轉(zhuǎn)化率,發(fā)酵周期壓縮25%,恒定pH亦不會額外增加酸堿用量。因此,選擇pH 7.0作為誘導(dǎo)pH。

2.4 誘導(dǎo)劑用量對工程菌的生長和DPEase酶表達(dá)的影響

Lac操縱子來源的啟動子經(jīng)常被用于原核表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌)的啟動表達(dá),乳糖及類似物作為誘導(dǎo)劑,IPTG被認(rèn)為是一種高效的非代謝性分子生物學(xué)誘導(dǎo)劑,但I(xiàn)PTG價格昂貴,誘導(dǎo)劑成本往往成為最大的原料成本[15],甚至可以決定一個工程菌產(chǎn)業(yè)化項目的利潤率高低,因此合適的誘導(dǎo)劑用量,即可以保證異源蛋白的有效表達(dá),又可以避免高價IPTG的浪費(fèi)。

本實(shí)驗(yàn)按照1.4.2描述的方法進(jìn)行5 L發(fā)酵培養(yǎng),初始pH7.0,培養(yǎng)至指數(shù)中期后降溫至25 ℃,并維持pH為7.0,待溫度和pH穩(wěn)定后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo),誘導(dǎo)劑的終濃度分別為0.2,0.5,1.0 mmol/L。誘導(dǎo)時長18 h,以考察不同誘導(dǎo)劑用量對工程菌生長和DPEase酶表達(dá)的影響。發(fā)酵結(jié)果及酶活轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)如圖6,7所示。

圖6 誘導(dǎo)劑用量對工程大腸桿菌生長的影響Fig.6 Effect of terminal concentration of IPTG on biomass growth

圖7 誘導(dǎo)劑用量對DPEase酶平衡轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 Effect of terminal concentration of IPTG on DPEase conversion rate

由圖6,7可知:誘導(dǎo)劑的影響非常顯著,其中圖6比較了誘導(dǎo)前后的生長趨勢,圖7顯示最適誘導(dǎo)劑濃度為0.5 mmol/L。IPTG作為一種強(qiáng)效誘導(dǎo)劑,對菌體具有一定的毒性,瞬間的濃度過高,導(dǎo)致異源蛋白非正常折疊的概率增加,非可溶性蛋白進(jìn)一步增加了菌體的生長負(fù)擔(dān),發(fā)酵中后期菌株逐漸適應(yīng),表現(xiàn)出輕微增長,低濃度的誘導(dǎo)劑收獲最高的生物量。對于DPEase酶的平衡轉(zhuǎn)化率,IPTG的終濃度符合0.1~1.0 mmol/L的經(jīng)驗(yàn)范圍[16],且在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),平衡轉(zhuǎn)化率先增后降,IPTG終濃度為0.5 mmol/L時對應(yīng)的平衡轉(zhuǎn)化率最高,達(dá)到27.6%。

3 結(jié) 論

對基因工程菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)的目的在于提高目的蛋白的表達(dá)產(chǎn)量,降低成本。目的基因的表達(dá)量,除了受菌株自身因素和質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響外,還受誘導(dǎo)工藝的影響,因此探索一套最優(yōu)的誘導(dǎo)工藝至關(guān)重要[17]。本研究系統(tǒng)考察了工程大腸桿菌NHRI-Ec01誘導(dǎo)表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的最優(yōu)條件,經(jīng)驗(yàn)證,生長初期溫度為37 ℃,指數(shù)中期(6 h)開始降溫至25 ℃,pH恒定7.0,待溫度和pH穩(wěn)定后,一次性加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)時長18 h,該工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)DPEase酶的平衡轉(zhuǎn)化率可達(dá)到28%,達(dá)到已公開報道的平均水平[5]。該誘導(dǎo)工藝同時兼顧能耗成本和發(fā)酵周期,為項目的下游工藝探索和提升提供了一定的參考依據(jù)。

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