佟世勝

副溶血弧菌是一種在各類海產(chǎn)中廣泛流行的重要病原菌，人們食用了未熟的水產(chǎn)品，極易引發(fā)胃腸道疾病，大多數(shù)食源性疾病都由此菌造成，也會(huì)引發(fā)食物中毒等嚴(yán)重疾病[1-3]，在全球范圍內(nèi)都有其爆發(fā)感染的報(bào)道。副溶血弧菌感染主要侵犯人體的胃腸道，若有身體有破潰，也會(huì)造成傷口感染，嚴(yán)重的可侵入人體循環(huán)系統(tǒng)。胃腸道感染副溶血弧菌的患者癥狀表現(xiàn)為中重度腹瀉，伴有惡心、嘔吐及腹部絞痛，部分也可出現(xiàn)發(fā)熱和里急后重[4]。與副溶血弧菌相關(guān)的毒力因子有很多，目前臨床上較為熱點(diǎn)的是有關(guān)耐熱直接溶血素（thermostable direct he-molysin，TDH）、耐熱直接相關(guān)溶血素（TDH-related he-molxsin，TRH）和Ⅲ型分泌系統(tǒng)的研究[5]。過去的大量研究已經(jīng)證實(shí)TDH、TRH 和TLH 三種溶血素對(duì)副溶血弧菌的致病性的影響，而它們的編碼基因已被確定為trh 和tdh 兩種[6]。Ⅲ型分泌系統(tǒng)近期受到眾多研究者的關(guān)注，目前的研究結(jié)果表明T3SS1 與細(xì)胞毒素有關(guān)，T3SS2 與腸毒素有關(guān)。本研究通過對(duì)68 例急性腹瀉患者的副溶血桿菌進(jìn)行毒力基因檢測(cè)及耐藥性調(diào)查，分析其病原特征和耐藥特點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）菌株來源：68 例副溶血弧菌分離自2019 年1-10 月本市腸道門診急性腹瀉患者的糞便樣本。（2）儀器與試劑：Vitek 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（法國(guó)生物梅里埃公司），藥敏紙片（英國(guó)Oxoid 公司）。DNA Engine PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。副溶血弧菌的毒力基因引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。相關(guān)培養(yǎng)基和生化試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 副溶血弧菌模板DNA 的提取 菌株分離標(biāo)準(zhǔn)參照《細(xì)菌性腹瀉臨床實(shí)驗(yàn)室診斷操作指南》，將分離的副溶血菌株移至培養(yǎng)皿中，在恒溫37 ℃下培養(yǎng)過夜，在10 000 r/min 下離心5 min，除去上清液，后加入1 mL 生理鹽水，并震蕩防止細(xì)菌成團(tuán)，重復(fù)上述離心工作；后向沉淀中加100 μL無菌蒸餾水重新震蕩懸浮后置100 ℃水浴10 min；13 000 r/min 離心10 min，上清即為PCR 擴(kuò)增所用的模板DNA，置于低溫環(huán)境保存

1.2.2 毒力基因檢測(cè) 檢測(cè)副溶血弧菌tdh、trh、tlh 基因攜帶情況，檢測(cè)技術(shù)采用單重聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。檢測(cè)T3SS1、T3SS2α 和T3SS2β 基因攜帶情況，技術(shù)選取多重PCR。引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列及反應(yīng)條件，見表1。

表1 副溶血弧菌tdh、trh、tlh基因攜帶情況

1.2.3 藥物敏感性試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)菌株藥敏試驗(yàn)選取于CLSI 推薦的Kirby-Bauer 紙片法。菌株轉(zhuǎn)種于血平板于溫度35 ℃經(jīng)過夜培養(yǎng)后，添加0.85%氯化鈉溶液將菌液調(diào)整到合適濃度，后將菌液涂滿于培養(yǎng)基表面，最后在培養(yǎng)基表面覆蓋藥敏紙片，經(jīng)恒溫孵育17 h 后對(duì)抑菌環(huán)直徑進(jìn)行測(cè)量。選擇15 種抗生素進(jìn)行研究，選用大腸埃希菌進(jìn)行質(zhì)控，參照CLSI M45-2016 的弧菌折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)和CLSI M100-S26E的腸桿菌科折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 觀察指標(biāo) 副溶血弧菌感染的毒力基因、副溶血弧菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 毒力基因分析 所有研究對(duì)象毒力基因tlh 全部顯示陽性，其中攜帶毒力基因tdh 的菌株有67 株，tdh 攜帶率為98.53%；2 株trh 陽性。65 株tdh（+）trh（-），2 株tdh（+）trh（+），1 株tdh（-）trh（-）。68 株副溶血弧菌均表達(dá)了T3SS1 基因，65 株tdh（+）trh（-）的菌株中有64 株表達(dá)了T3SS2α基因，2 株tdh（+）trh（+）的菌株中有1 株表達(dá)了T3SS2β 基因，其余菌株未發(fā)現(xiàn)。見表2。

表2 68株副溶血弧菌T3SS分布 株

2.2 藥物敏感性測(cè)試結(jié)果 副溶血弧菌對(duì)碳?xì)涿瓜╊惪股氐拿舾行宰罡哌_(dá)100%，所有菌株對(duì)氯霉素、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明和碳?xì)涿瓜╊惪咕幬铮▉啺放嗄稀⒚懒_培南）敏感；90%以上的菌株對(duì)頭孢曲松、阿奇霉素和慶大霉素敏感；對(duì)氨芐西林耐藥率最高為86.8%，磺胺異噁唑耐藥率次之為67.6%。見表3。

表3 副溶血弧菌對(duì)16種抗生素的耐藥情況 例（%）

3 討論

副溶血弧菌在全世界均廣泛存在并流行，是經(jīng)口引起疾病的重要菌，最主要是途徑是使用海產(chǎn)品，進(jìn)而導(dǎo)致的胃腸炎[7]，在中國(guó)食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)報(bào)道的細(xì)菌性食源性疾病暴發(fā)疫情中，副溶血弧菌相關(guān)的中毒事件占總數(shù)1 060 起的29%[8]，多達(dá)308 起。在全球范圍內(nèi)也有其爆發(fā)感染的報(bào)道。許多城市早年報(bào)道曾有感染副溶血弧菌的病例，短短幾年時(shí)間，感染人數(shù)上升至幾千人，未得到有效控制[9-10]。Mao等[11]借助文獻(xiàn)法推理演算出，因副溶血弧菌引發(fā)的食物中毒在中國(guó)每年約發(fā)生495.1 萬人次，繼而引發(fā)的急性胃腸炎在發(fā)達(dá)國(guó)家中出現(xiàn)率遠(yuǎn)小于中國(guó)，但關(guān)于本病產(chǎn)生的醫(yī)療費(fèi)用極高。副溶血弧菌感染人體后引起的相關(guān)疾病主要包括腹瀉、胃腸炎、傷口感染，嚴(yán)重可致敗血癥。被報(bào)道最多的相關(guān)疾病是食源性腹瀉。副溶血弧菌產(chǎn)生的毒力因子中，溶血素是目前受到了較多的關(guān)注和研究。在臨床和環(huán)境分離株中同時(shí)存在并有顯著的種屬特異性的基因是tlh 基因，在以前的認(rèn)知中，tdh 基因編碼的TDH或trh 基因編碼的TRH 與副溶血弧菌的致病性有相關(guān)性。T3SS 由T3SS1 和T3SS2 組成，分別位于染色體1 和染色體2 上，其中T3SS2 由兩種亞型組成，分別是T3SS2α 和T3SS2β 兩種[12]，根據(jù)當(dāng)前的研究結(jié)果可知，T3SS1 與細(xì)胞毒素存在聯(lián)系，T3SS2與腸毒素存在聯(lián)系。

一般情況下，實(shí)驗(yàn)室分離株均可產(chǎn)生“神奈川現(xiàn)象”（kanagawa phenomenon，KP），出現(xiàn)一種特殊的血瓊脂上的β-溶血現(xiàn)象，即KP+，這種現(xiàn)象被認(rèn)為與TDH 相關(guān)。紅細(xì)胞可以被TRH 與TDH溶解，且兩者均可以產(chǎn)生小動(dòng)物致死腸毒素，兩者存在著相似的毒性作用。另外，大（chr I）、?。╟hr Ⅱ）2 條染色體在絕大部分副溶血弧菌中均可以被發(fā)現(xiàn)，每條染色體各自毒力基因編碼T3SS1 和T3SS2[12]。副溶血弧菌的T3SS 包括分泌裝置和效應(yīng)蛋白，其中分泌裝置由多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白組成，效應(yīng)蛋白由分泌裝置分泌。T3SS1 的細(xì)胞毒性為主要作用，所有副溶血弧菌中均存在；KP+臨床分離菌株中發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的T3SS2[13]。

TDH 是一種細(xì)胞毒素，同時(shí)作為一種蛋白質(zhì)被染色體上的tdh 基因編碼，特征是溶血活性、細(xì)胞毒性和腸毒素活性[14]。本研究顯示，副溶血弧菌毒力基因tlh 全部呈現(xiàn)陽性的數(shù)量為68 株，具有顯著的種屬特異性；毒力基因tdh 陽性的數(shù)量為67 株，其攜帶率為98.5%，為證實(shí)副溶血弧菌最主要的致病因子是TDH 提供了證據(jù)。trh 基因編碼TRH，故可導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解并產(chǎn)生小動(dòng)物致死腸毒素，與其相近毒性的還有TDH。本研究中，出現(xiàn)2 株基因型表現(xiàn)為tdh（+）trh（+）的菌株，其trh 基因呈陽性，相關(guān)研究證據(jù)提示tdh（+）trh（+）基因型的感染性強(qiáng)于其他基因型[15]；而tdh（-）trh（-）的基因型在1 株菌株中出現(xiàn)，推測(cè)副溶血弧菌菌株中還可能存在除TDH 和TRH 外的獨(dú)立致病因子，但本結(jié)果未排除其他致病性細(xì)菌的混合感染導(dǎo)致的患病。業(yè)界一致認(rèn)為，除TDH 與TRH 外，T3SS 同樣是潛在的與副溶血弧菌致病性相關(guān)的毒力因子[16]。副溶血弧菌的T3SS 包含由的效應(yīng)蛋白通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌到宿主細(xì)胞，這一過程對(duì)宿主可產(chǎn)生致病性[17]。研究人員認(rèn)識(shí)到副溶血弧菌含有2 套T3SS（T3SS1 和T3SS2），這一發(fā)現(xiàn)建立于該菌的全基因組測(cè)序[18]。T3SS1 位于染色體1 上，產(chǎn)生的細(xì)胞毒性介導(dǎo)細(xì)胞的自體吞噬，主要作用于宿主細(xì)胞，導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡。T3SS2 位于染色體2 的毒力島上，只存在于KP+的副溶血弧菌中。副溶血弧菌T3SS2 被證明不能同時(shí)但可攜帶tdh、T3SS2α 或trh、T3SS2β 基因。

本研究中，T3SS1 基因表達(dá)全部出現(xiàn)在68 株副溶血弧菌中，可借助T3SS1 基因特異性作為副溶血弧菌的鑒定菌株；tdh（+）trh（-）菌株中均攜帶T3SS2α 基因，菌株數(shù)達(dá)64 株，這一結(jié)果與國(guó)內(nèi)其他相關(guān)研究報(bào)道的攜帶T3SS2α 基因的菌株，其攜帶的毒力基因tdh 也是陽性一致[19]。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)僅tdh（+）trh（+）的菌株中存在T3SS2β 基因，表明trh（+）的存在與T3SS2β 的表達(dá)存在關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果表明，副溶血弧菌對(duì)氨芐西林和磺胺異噁唑的耐藥率分別達(dá)86.8%和67.6%，與蔡彥秋等[20]的研究結(jié)果相符，表明本研究分離的副溶血弧菌的耐藥性對(duì)這2 種抗菌藥物比較嚴(yán)重，臨床應(yīng)對(duì)這一現(xiàn)象加以關(guān)注。本研究中，共24 株副溶血弧菌對(duì)鏈霉素和阿米卡星出現(xiàn)了一定程度的耐藥表現(xiàn)，而氯霉素、復(fù)方新諾明、強(qiáng)力霉素和碳?xì)涿瓜╊惪咕幬铮▉啺放嗄稀⒚缆迮嗄希┑膶?duì)本菌株的殺滅效果為100%。

綜上所述，針對(duì)感染性腹瀉患者，如已確定致病菌為副溶血弧菌，臨床在進(jìn)行抗生素的選擇時(shí)，應(yīng)以美羅培南或亞胺培南等碳?xì)涿瓜╊惪股貫槭走x，其次考慮應(yīng)用頭孢曲松為代表的頭孢類藥物。