周巍，趙彥鵬

(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，河南 信陽(yáng)464000)

鼠李(RhamnusdavuricaPall)，鼠李科鼠李屬植物，落葉小喬木或灌木，生于山坡林下，在我國(guó)分布廣泛，河南、山西、吉林等省均有分布[1]。鼠李有重要的藥用價(jià)值，它可用于清熱利濕、消積通便等癥狀。研究表明[2]，鼠李果實(shí)中含有大黃素、大黃酚、萜類化合物、有機(jī)酸、多糖類等多種物質(zhì)。多糖是一種重要的生命活性物質(zhì)，多糖因具有優(yōu)良的抗自由基功能以及抗腫瘤作用[3]，在食用和醫(yī)學(xué)方面具有廣泛應(yīng)用。多糖也是很好的免疫增強(qiáng)劑，該特性對(duì)新型醫(yī)藥產(chǎn)品的研發(fā)提供了思路[4]。但迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)鼠李果實(shí)多糖的研究還未見報(bào)道，因此，本研究通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化鼠李果實(shí)多糖的提取工藝，以期對(duì)鼠李果實(shí)多糖資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論和實(shí)踐參考[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：鼠李果實(shí)，產(chǎn)地河南，采自河南省信陽(yáng)市金牛山。選取干燥果實(shí)，用粉碎機(jī)完全粉碎后過(guò)100目篩，備用。試劑：5 %苯酚(現(xiàn)配現(xiàn)用)，丙酮、乙醚、葡萄糖、無(wú)水乙醇、濃硫酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

表1 使用的主要儀器

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鼠李果實(shí)粗多糖提取工藝流程 鼠李果實(shí)粉末→熱水浸提→離心取上清液→減壓濃縮→加4倍無(wú)水乙醇→丙酮、乙醚洗滌沉淀→真空干燥→鼠李果實(shí)粗多糖。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用電子分析天平準(zhǔn)確稱取葡萄糖(預(yù)先在105 ℃下經(jīng)干燥至恒重)2.5000 g于500 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，室溫下放置30 min，待充分溶解后移取2 mL，定容于100 mL容量瓶中。得濃度為100μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別用移液管移取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于20 mL具塞試管中，加水至2 mL，搖勻，然后加入1mL體積分?jǐn)?shù)5 %苯酚，搖勻后，加入5 mL濃硫酸，振蕩搖勻后放于試管架上，室溫下放置15 min左右。以2 mL蒸餾水為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)490 nm條件下測(cè)定溶液的吸光度[6]。作濃度-吸光度曲線圖，如圖1。通過(guò)回歸分析得到線性回歸函數(shù)為：Y=0.0124S+0.1577，R2=0.9963。

圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 多糖的測(cè)定 多糖測(cè)定采用苯酚-硫酸法[7]。由圖1可知濃度-吸光度的函數(shù)方程為：Y=0.0124S+0.1577，R2=0.9963，Y為吸光度/(A), S為葡萄糖濃度/(μg/mL)。鼠李果實(shí)多糖提取率計(jì)算公式如下：

1.3.4 單因素試驗(yàn) 液料比對(duì)多糖提取率的影響：準(zhǔn)確稱取1.0000 g鼠李果實(shí)粉末，設(shè)置梯度液料比為45:1、50:1、55:1、60:1、65:1(mL/g)，水浴時(shí)間設(shè)定為1.5 h，水浴溫度設(shè)定為80 ℃，在恒溫水域鍋中提取，冷卻離心(3000 r/min)，取2 mL上清液于15 mL具塞管中，加1 mL苯酚，5 mL濃硫酸，室溫下放置15 min，測(cè)定溶液吸光度值。

提取溫度對(duì)多糖提取率的影響：準(zhǔn)確稱取1.0000 g鼠李果實(shí)粉末，加入55 mL蒸餾水，水浴時(shí)間設(shè)定為1.5 h，提取溫度為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃, 在恒溫水域鍋中進(jìn)行提取，冷卻離心(3000 r/min)。取2 mL上清液于15 mL具塞管中，加1 mL苯酚，5 mL濃硫酸，室溫下放置15 min,測(cè)定溶液吸光度值。

提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響：準(zhǔn)確稱取1.0000 g鼠李果實(shí)粉末，加入55 mL蒸餾水，設(shè)置提取溫度80 ℃，設(shè)置梯度提取時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，在恒溫水域鍋中進(jìn)行提取，冷卻離心(3000 r/min)。取2 mL上清液于15 mL具塞管中，加1 mL苯酚，5 mL濃硫酸，室溫下放置15 min, 測(cè)定溶液吸光度值。

1.3.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)三因素優(yōu)化鼠李果實(shí)多糖提取率的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。利用Design-Expert軟件，根據(jù)Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，建立多元二次回歸模型方程，用多項(xiàng)式對(duì)本實(shí)驗(yàn)中三個(gè)因素與指標(biāo)的相互關(guān)系進(jìn)行近似擬合，通過(guò)對(duì)回歸函數(shù)的分析及各因素相互作用的響應(yīng)面圖形分析來(lái)尋求最佳工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比對(duì)鼠李果實(shí)多糖提取率的影響 由圖2可知，在液料比較小時(shí)考慮到多糖未能充分溶解，所以多糖提取率隨液料比的增大而逐漸增加，在液料比達(dá)到55:1時(shí)，再增加液料比時(shí)多糖的提取率變化不大，不再有明顯的波動(dòng)情況。因此在考慮成本的情況下取液料比55:1為最佳條件。

圖2液料比對(duì)鼠李果實(shí)多糖提取率的影響 圖3提取溫度對(duì)鼠李果實(shí)多糖提取率的影響

2.1.2 提取溫度對(duì)鼠李果實(shí)多糖提取率的影響 如圖3可知，在設(shè)定條件范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高多糖提取率逐漸提高，在溫度達(dá)到70 ℃時(shí)提取率達(dá)到峰值，之后增加溫度多糖提取率逐漸下降，可能是過(guò)高的溫度導(dǎo)致多糖降解。因此，最佳溫度條件設(shè)定為70 ℃。

圖4提取時(shí)間對(duì)鼠李果實(shí)多糖提取率的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)鼠李果實(shí)多糖提取率的影響 如圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到1.5 h時(shí)，鼠李果實(shí)多糖提取率達(dá)到最大值。在低于1.5 h時(shí)多糖提取率隨著提取時(shí)間的增加逐漸提高，在高于1.5 h時(shí)多糖提取率逐漸下降，可能是過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間導(dǎo)致多糖分解。因此，最佳提取時(shí)間選取1.5 h。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 分析因素的選擇及分析方案 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定以下三個(gè)因素的三個(gè)不同編碼水水平進(jìn)行鼠李果實(shí)多糖提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)方案[8]，如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析因素與水平表

實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果如表3所示。

表3 實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn) 使用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表3中鼠李果實(shí)多糖提取率進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程：

Y=1.11+0.098·A-1.625·10-3·B-2.500·10-3·C-2.250·10-3·AB+3.500·10-3AC-4.500·10-3·BC-0.10·A2-0.10·B2-0.10·C2；方程反映了提取時(shí)間、液料比、提取溫度與提取率的關(guān)系。

2.2.3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析 對(duì)鼠李果實(shí)多糖提取率的回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4。

從表4可知，模型P<0.001<0.01,方程回歸極顯著；該回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，又因?yàn)樵撃Ｐ偷氖M項(xiàng)P=0.0997>0.05，說(shuō)明模型擬合度高，可以用來(lái)描述鼠李果實(shí)多糖提取率與其影響因素之間的關(guān)系，該試驗(yàn)方法可靠[9]。另外，F(xiàn)A>FC>FB,說(shuō)明液料比對(duì)鼠李果實(shí)多糖提取率影響最大，其次是提取溫度，提取時(shí)間影響最小。

表4 方差分析

注：**為及其顯著(P<0.01);*為顯著(0.01

2.2.4 多糖提取率的響應(yīng)面分析 由表4可知，模型中一次項(xiàng)A的P<0.0001, 說(shuō)明差異極顯著；一次項(xiàng)B的P>0.05, 差異不顯著。FA>FB表明液料比比提取時(shí)間對(duì)鼠李果實(shí)多糖的提取率影響更大。

由圖6可知，存在液料比和提取溫度的最佳組合，但液料比的變化趨勢(shì)比提取溫度的變化趨勢(shì)顯著，這顯示液料比對(duì)鼠李果實(shí)多糖提取率的影響更大。

圖5Y=f(A,B)的響應(yīng)面 圖6Y=(A,C)的響應(yīng)面 圖7Y=(B,C)的響應(yīng)面

圖7表明，提取溫度和提取時(shí)間所構(gòu)成的響應(yīng)面圖形有最高點(diǎn)，兩因素交互作用顯著，所以二者存在最優(yōu)組合[9-10]；另外曲面的變化趨勢(shì)也十分相似，但提取溫度比提取時(shí)間略微陡峭一點(diǎn)，因此提取溫度對(duì)鼠李果實(shí)多糖提取率的影響更大些。

圖5、圖6、圖7直觀地反映了液料比、提取溫度、提取時(shí)間三個(gè)因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，綜合分析可以看出提取時(shí)間和提取溫度(BC)交互作用曲面的坡度最陡峭，表明其對(duì)鼠李果實(shí)多糖提取率的交互作用最明顯。

2.2.5 最佳工藝條件的優(yōu)化 利用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)優(yōu)化，鼠李果實(shí)多糖提取的最佳工藝組合為：液料比為53:1，提取時(shí)間為1.5 h，提取溫度為69.80 ℃，考慮到實(shí)際試驗(yàn)的可操作性，鼠李果實(shí)多糖提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為：液料比為53:1，提取時(shí)間為1.5 h，提取溫度為70 ℃，此時(shí)鼠李果實(shí)多糖的理論提取率為1.0501 %。

2.2.6 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 為驗(yàn)證理論結(jié)果的準(zhǔn)確性，按照理論條件進(jìn)行了3次驗(yàn)證試驗(yàn)，3次試驗(yàn)結(jié)果表明鼠李果實(shí)多糖的提取率平均值為1.0508 %，與上述預(yù)測(cè)值1.0501 %相對(duì)誤差較小。

3 討論與結(jié)論

為探討鼠李果實(shí)多糖的最佳提取工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert軟件，依據(jù)Box-Benhnken原理，對(duì)鼠李果實(shí)多糖提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，鼠李果實(shí)多糖的最佳提取工藝條件為：液料比為53:1，提取時(shí)間為1.5 h，提取溫度為69.80 ℃，考慮到實(shí)際試驗(yàn)的可操作性，鼠李果實(shí)多糖提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為：液料比為53:1，提取時(shí)間為1.5 h，提取溫度為70 ℃，此時(shí)鼠李果實(shí)多糖的理論提取率為1.0501%。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可行的。所以說(shuō)利用響應(yīng)面法優(yōu)化鼠李果實(shí)多糖的工藝參數(shù)可靠有效，可為進(jìn)一步研究鼠李果實(shí)多糖提供參考。

由于實(shí)驗(yàn)中提取的是粗多糖，多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，所以不同的多糖具有不同的生物活性。因此后續(xù)還需要進(jìn)一步研究其組成、結(jié)構(gòu)等。