梁利香，周斌，喬新榮

(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院，信陽(yáng)市中藥資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心，信陽(yáng)市中藥質(zhì)量分析檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，河南 信陽(yáng) 464000)

貓爪草為毛茛科植物小毛茛(RadixRanunculiTernati.)的干燥塊根，性溫，味甘、辛，歸肝、肺經(jīng)，功能化痰散結(jié)、解毒消腫，用于治療瘰疬痰核、疔瘡腫毒、蛇蟲咬傷[1]。貓爪草含有多種成分，如糖類、黃酮類與苷類、氨基酸、生物堿苷類、有機(jī)酸、甾醇及酯、揮發(fā)油和微量元素等，具有抗結(jié)核、抗菌、抗癌、免疫調(diào)節(jié)作用、保護(hù)性抑制作用、抗氧化作用等多種藥理活性[2]。貓爪草近年來(lái)由于其抗腫瘤活性備受人們的關(guān)注，諸多實(shí)驗(yàn)研究表明貓爪草多糖(PRT)是其抗腫瘤、抗氧化、保肝、調(diào)節(jié)免疫的活性成分[3-8]。河南貓爪草種植和產(chǎn)量在全國(guó)占有重要地位，尤其信陽(yáng)地區(qū)既是貓爪草的發(fā)現(xiàn)地和野生分布區(qū)，又是目前國(guó)內(nèi)貓爪草的主要栽培區(qū)。為了更好控制河南貓爪草質(zhì)量，本文按照《中國(guó)藥典》(2015年版)對(duì)河南產(chǎn)貓爪草從性狀鑒別、橫切面顯微鑒別、薄層色譜鑒別、水分、總灰分、酸不溶性灰分檢查和稀乙醇浸出物測(cè)定等方面進(jìn)行了研究，并增加粉末顯微鑒別、粗多糖和多糖含量測(cè)定項(xiàng)目。以期為河南產(chǎn)貓爪草的質(zhì)量控制、河南產(chǎn)貓爪草的道地性、原產(chǎn)地標(biāo)記的認(rèn)定、資源開發(fā)和質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料 貓爪草藥材從不同產(chǎn)地收集，由信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院、信陽(yáng)市中藥質(zhì)量分析檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定為毛茛科植物小毛茛(RanunculusternatusThunb.)的干燥塊根。樣品信息見表1。

1.1.2 試劑 無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)為GBW1006213001,含量為99%)；酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、無(wú)水硫酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、正丁醇、無(wú)水乙醇、冰醋酸等均為分析純，純化水自制。

1.1.3 儀器 TU-1810紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；AB-135-S型電子天平(梅特勒-托利多儀器制造有限公司)；SCQ -8201E 超聲清洗儀(上海聲彥超聲波儀器設(shè)備有限公司)；Carl Zeiss Primo Star可攝像生物顯微鏡(德國(guó)卡爾蔡司公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

1.2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 將葡萄糖對(duì)照品干燥至恒重，精密稱定0.1042 g 于100 ml容量瓶中，加純化水充分溶解后，稀釋至刻度，搖勻，制得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表1 貓爪草樣品信息

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密移取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于6只100 mL容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻后得葡萄糖對(duì)照品溶液。

精密稱取蒽酮0.1 g，加100 mL硫酸溶解，搖勻后即得硫酸蒽酮溶液。

分別精密移取各對(duì)照品溶液1.0 mL于10 mL具塞試管后，將試管置冰水浴中，迅速加入4.0 mL 硫酸蒽酮溶液。再將試管置沸水浴中顯色10 min后，取出置冰水浴中冷卻10 min，然后將試管在室溫下放置 10 min。同時(shí)移取1.0 mL純化水，同法操作，作為空白溶液。按照紫外-可見分光光度法[9]，在625nm處測(cè)其吸光度。以濃度(C)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=0.01037C + 0.00907(r=0.9994)。結(jié)果表明：葡萄糖在10.42～62.52μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2 貓爪草中多糖的含量測(cè)定

1.2.2.1 供試品溶液的制備 貓爪草藥材各樣品粉碎后，過(guò)60目篩網(wǎng)。取每種樣品粉末1.5g，各取3份。每份加約0.045g的α-淀粉酶和3倍量的純化水進(jìn)行酶解。酶解溫度為 50℃，酶解溶液pH為6 ，酶解時(shí)間設(shè)為40min。酶解結(jié)束后，再加7倍量純化水超聲提取20 min，超聲功率為300 W。然后進(jìn)行抽濾。濾渣再加純化水超聲提取2次，每次加水量為8倍量，每次提取時(shí)間為20 min，合并3次經(jīng)酶解、協(xié)同超聲提取所得的提取液，將其濃縮至原體積的1/2 , 過(guò)濾，棄去前濾液10 mL，收集續(xù)濾液。精密移取續(xù)濾液1.0 mL于50 mL容量瓶中，加純化水至刻度，即得供試品溶液。

1.2.2.2 多糖溶液的制備 精密移取1.2.2.1項(xiàng)下貓爪草總糖續(xù)濾液10 mL于50 mL燒杯中，60℃條件下干燥。干燥后，加入1 mL純化水溶解，邊攪拌邊加入10 mL無(wú)水乙醇，靜置30min后，過(guò)濾，將沉淀全部轉(zhuǎn)移至濾紙上，用純化水-無(wú)水乙醇(1：10)的溶液洗滌沉淀3次。將帶濾紙的漏斗移至 25 mL的容量瓶上，多次用純化水沖洗將沉淀完全溶解加入容量瓶中，加純化水至刻度，即得多糖溶液。

1.2.2.3 多糖含量測(cè)定方法 精密移取各供試品溶液1.0 mL于10 mL具塞試管中，下起同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下“置冰水浴中”，測(cè)定其吸光度，并計(jì)算其含量。

1.2.3 薄層色譜實(shí)驗(yàn) 分別吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液各8μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-無(wú)水乙醇-冰醋酸-水(8：2：2：3)為展開劑展開后，取出晾干，再噴以茚三酮試液，熱風(fēng)吹薄層板至斑點(diǎn)顯色清晰。

2 鑒別結(jié)果

2.1 來(lái)源鑒別

貓爪草為一年生草本，多生長(zhǎng)在光照充足的路邊、山腳、田野、溪邊和濕潤(rùn)的草地。粗短的根莖上著生簇狀的塊根。莖較柔軟纖弱，鋪散，高5～20 cm?；~叢生，葉柄長(zhǎng)，葉片幼小時(shí)多單葉，近全緣，基部近心形。后逐漸至淺裂、3深裂或多次狹細(xì)分裂。莖生葉近無(wú)柄，且葉片多分裂成3～5狹長(zhǎng)條狀裂片。莖多分枝，花單生莖頂端和分枝頂端，直徑1～1.8cm，萼片5～7枚，外表皮上著生稀疏的柔毛?；ò?～8枚，多5枚，初開時(shí)亮黃色，逐漸變?yōu)榘咨?。栽培大田中出現(xiàn)少數(shù)黃、白色塊夾雜的花朵情形?；ㄍ型獗砻鏌o(wú)毛。聚合果近似球形，瘦果卵形。早春3月開花，果實(shí)5～6月成熟。果實(shí)成熟后地上部分逐漸枯萎。見圖1、圖2。

圖1貓爪草初開放的花 圖2少數(shù)貓爪草的花黃白色塊夾雜

2.2 性狀鑒別

貓爪草實(shí)際入藥部位由粗短的根莖及根莖上數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)紡錘形簇生的塊根組成，形似貓爪，頂端有黃褐色殘存的莖或莖痕。表面黃褐色至灰黃色，略有縱皺紋，并有點(diǎn)狀須根痕或殘留須根。質(zhì)堅(jiān)實(shí)，斷面白色或黃白色，多實(shí)心，偶見有裂隙，粉性。氣微，味微甘。見圖3。

2.3 顯微鑒別

2.3.1 橫切面顯微鑒別 根莖皮層分布有數(shù)個(gè)須根維管束，木質(zhì)部和韌皮部相間排列。塊根的表皮細(xì)胞切向延長(zhǎng)，黃棕色，有的分化為表皮毛，微木化。皮層由20～30列細(xì)胞組成，壁稍厚，有紋孔，內(nèi)皮層明顯。中柱小，木質(zhì)部、韌皮部各2～3束，間隔排列。薄壁細(xì)胞充滿淀粉粒。結(jié)果見圖4、圖5。

圖3貓爪草藥材圖 圖4貓爪草須根維管束顯微圖 圖5貓爪草橫切面顯微圖

圖6貓爪草粉末顯微特征圖

2.3.2 粉末顯微鑒別 本品粉末淡棕色至黃棕色。導(dǎo)管多為具緣紋孔導(dǎo)管和螺紋導(dǎo)管，木質(zhì)化。具緣紋孔導(dǎo)管紋孔較為密集，寬25～100μm，有的末端斜尖；螺紋導(dǎo)管寬為10～35μm。管胞木化，具緣紋孔密集，寬7～15μm，長(zhǎng)120～350μm。表皮細(xì)胞狹長(zhǎng)，橫切面觀，寬6～12μm，長(zhǎng)85～178 μm，黃棕色，最外層表皮細(xì)胞多分化為基部寬，上部呈窄長(zhǎng)的毛狀。表皮毛非木化，上部寬8～15 μm，有的有分支和多個(gè)橫隔，多斷裂。皮層細(xì)胞橫切面觀卵圓形、類三角形或圓形，直徑20～188 μm，縱切面觀圓柱形，長(zhǎng)107～350 μm。壁較厚，上有稀疏排列的狹長(zhǎng)單紋孔，上下橫壁上網(wǎng)狀紋孔密集。皮層細(xì)胞充滿淀粉粒。淀粉粒單粒呈球形、類球形或成多面錐體，直徑8～25μm，臍點(diǎn)點(diǎn)狀。淀粉粒多為多面錐體，低倍鏡下觀察，臍點(diǎn)如十字形、人字形或星芒狀。塊根根尖組織細(xì)胞類長(zhǎng)方形、類方形或卵圓形，直徑70～100 μm，棕色或無(wú)色，有的可見稀疏的細(xì)小點(diǎn)狀紋孔，內(nèi)含深棕色核狀物(見圖6)。

偶爾可以看見莖葉等地上部分混淆進(jìn)去的粉末特征。如氣孔，多為不定式或環(huán)式；非腺毛，有分枝；或分泌組織。見圖7。

2.4 薄層色譜鑒別

色譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8。1～4樣品供試品色譜中，在與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.5 多糖含量測(cè)定結(jié)果

貓爪草中多糖含量的測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 貓爪草中多糖含量(n=3)

表2(續(xù))

由表2可知，河南信陽(yáng)地區(qū)貓爪草的多糖含量為30.78%(n=6，RSD=4.27%)。用單因素方差分析得其與商丘(樣14)、周口(樣15)、平頂山(樣16)和開封(樣17)不具有顯著性差異(p>0.05)，但其分布量較大，且與其余7個(gè)采樣點(diǎn)(7-13)差異顯著(p<0.01)。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明：河南不同產(chǎn)地貓爪草的性狀、塊根的橫切面顯微特征、TLC鑒別基本一致，無(wú)顯著差異；河南不同產(chǎn)地貓爪草多糖的含量差異明顯，以河南信陽(yáng)淮濱產(chǎn)貓爪草多糖的含量最高，河南信陽(yáng)淮濱和息縣產(chǎn)貓爪草中多糖的含量無(wú)明顯差異，但均高于其它地區(qū)。為信陽(yáng)是優(yōu)質(zhì)高效的貓爪草道地藥材產(chǎn)區(qū)提供了一定的判斷依據(jù)。

貓爪草根頂端應(yīng)為粗短的根莖，但因須根較多，簇生的塊根也較多，本研究所做橫切片還不十分滿意，需要進(jìn)一步觀察研究。貓爪草入藥時(shí)常含有少量非入藥部位，觀察粉末顯微特征時(shí)要注意區(qū)分。大田栽培的貓爪草的花出現(xiàn)黃白夾雜色塊的原因需要進(jìn)一步探明。

貓爪草的采收期通常為5月上旬，本試驗(yàn)中17個(gè)產(chǎn)地貓爪草多糖含量的平均值的80%為23.25%。多糖含量是否與采收時(shí)間、地域、氣候、土壤環(huán)境、生長(zhǎng)年限、種植方式等有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。