楊 璐，陸耀飛

（上海體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院， 上海200438）

骨骼肌損傷是運(yùn)動(dòng)中常見的運(yùn)動(dòng)性損傷疾病，以疼痛、局部腫脹、肌張力降低、功能障礙為主要表現(xiàn)。在運(yùn)動(dòng)引起的損傷中，骨骼肌損傷的發(fā)生率為10%～55% 不等，由于骨骼肌再生能力有限，導(dǎo)致自然修復(fù)效果不佳，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量（Herridge et al.，2003）。因此，提高肌肉恢復(fù)能力和改善肌肉損傷后的治療方法具有重要的臨床價(jià)值。

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞作為肌源干細(xì)胞已被廣泛研究。骨骼肌的損傷修復(fù)依賴于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增殖、分化。有研究者發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)能夠激活骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞并且促進(jìn)其增殖（Pallafacchina et al.，2013）。機(jī)械牽拉作為模擬運(yùn)動(dòng)的一種方式，近年來(lái)已被應(yīng)用于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的研究。有研究表明，機(jī)械牽拉能夠促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活和增殖（Kook et al.，2008），抑制分化（史仍飛等，2012），并且與牽拉程度存在相關(guān)性。然而，機(jī)械牽拉對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未闡述清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)通過離體培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，研究機(jī)械牽拉對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的作用，初步探究可能的作用途徑，為骨骼肌損傷修復(fù)及細(xì)胞肥大過程提供理論依據(jù)。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠 2 只，2～3 周齡，體重 90 g，由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，SCXK（2013-0016）。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM 培養(yǎng)液（Gibco）、胎牛血清（Gibco）、馬血清（Gibco），青霉素、鏈霉素（Amresco）、Ⅱ型膠原酶（Sigma）、胰酶（Gibco）、CCK-8 試劑盒（日本同仁堂）、α 橫紋肌肌動(dòng)蛋白（武漢博士德）、SABC 試劑盒（武漢博士德）、DAB試劑盒（武漢博士德）。

1.3 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞原代培養(yǎng)

10% 的水合氯醛以0.4 ml/100 g 的劑量腹腔注射麻醉大鼠，約5 min 后，待其疼痛反射和角膜反射均消失后，浸泡至75% 的酒精中，2 min 后，仰臥位固定大鼠。在無(wú)菌條件下分離雙側(cè)腿部比目魚肌、腓腸肌和背部肌肉。去除筋膜、血管、脂肪等組織，充分剪碎至1 mm3。在剪碎的肌肉中加入0.1%Ⅱ型膠原酶30 ml，在37℃條件下攪拌器攪拌 1 h，1 000 轉(zhuǎn)/分離心 15 min 后，棄上清。再加入 0.25%胰酶30 ml，37℃消化15 min，胎牛血清終止消化，1 000 轉(zhuǎn)/分離心15 min，棄上清。加入種植培養(yǎng)液吹打混勻，依次通過100 目、200 目、400 目細(xì)胞篩過濾。接種于未經(jīng)多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2，100% 空氣濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 h 后將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液置于未經(jīng)多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中。2 h 后，將第一次差速貼壁完的細(xì)胞接種于經(jīng)多聚賴氨酸的包被的培養(yǎng)瓶中，24 h后首次換液，之后每2 天換1 次液。

1.4 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞傳代培養(yǎng)

吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，PBS 清洗2 次，棄去PBS。加入0.25% 胰蛋白酶2 ml，37℃消化2 min，并用巴氏吸管充分吹打瓶壁，待大部分細(xì)胞從瓶壁上脫落時(shí)，加入1 ml 胎牛血清終止消化，1 000 轉(zhuǎn)/分離心10 min。棄上清，加生長(zhǎng)培養(yǎng)液充分吹打制成細(xì)胞懸液后，接種到新的培養(yǎng)瓶中。

1.5 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞純度鑒定

取第三代的細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至3×105個(gè)/孔，接種于放有蓋玻片12 孔板內(nèi)，將培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2，100% 空氣濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出12 孔板，用PBS漂洗3次。4%多聚甲醛固定為20 min，用PBS漂洗3次，3 min/次。 以 75%、85%、95% 濃度酒精依次脫水，3 min/次，用 PBS 漂洗 3 次，3 min/次。3% H2O2滅活內(nèi)源性的過氧化物酶，室溫浸泡 30 min，用 PBS 漂洗 3 次，3 min/次。滴加5% BSA 封閉液，室溫孵育20 min，除去多余液體。滴加一抗（1：100 稀釋的橫紋肌肌動(dòng)蛋白抗體），4℃過夜，用PBS 漂洗3 次，3 min/次。滴加二抗（生物素化山羊抗小鼠Ig G），37℃孵育 20 min，用 PBS 漂洗 3 次，3 min/次。滴加復(fù) 合 SABC，37℃ 孵 育 20 min，PBS 洗 滌 3 次 ，5 min/次 。DAB 顯色后，蘇木素復(fù)染2 min。取出玻片，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取6 個(gè)視野拍照，計(jì)算細(xì)胞純度。細(xì)胞純度（100%）=（細(xì)胞總數(shù)-陰性細(xì)胞數(shù)）÷細(xì)胞總核×100%。

1.6 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的機(jī)械牽拉

取第三代細(xì)胞，將衛(wèi)星細(xì)胞的密度調(diào)制2×105個(gè)/ml后種植在牽拉板，在牽拉板上繼續(xù)培養(yǎng)24 h 使細(xì)胞完全貼壁，然后對(duì)細(xì)胞以1 Hz 的頻率進(jìn)行周期性機(jī)械牽拉。將細(xì)胞分組如下：

對(duì)照組（C）：不施加任何牽拉；

5% 拉伸度 4 h 組（5%S 4 h）：以 5% 的機(jī)械牽拉強(qiáng)度牽拉4 h；

5% 拉伸度 6 h 組（5%S 6 h）：以 5% 的機(jī)械牽拉強(qiáng)度牽拉6 h；

15% 拉伸度 4 h 組（15%S 4 h）：以 15% 的機(jī)械牽拉強(qiáng)度牽拉4 h；

15% 拉伸度 6 h 組（15%S 6 h）：以 15% 的機(jī)械牽拉強(qiáng)度牽拉6 h。

1.7 CCK-8檢測(cè)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖

牽拉結(jié)束后放置培養(yǎng)箱中，24 h 后換液，每孔加入1 ml生長(zhǎng)培養(yǎng)液和100 ulCCK8 溶液使其完全覆蓋細(xì)胞，并輕輕搖晃均勻，孵育2 h 后，將待測(cè)液加入96 孔板中，以吸光度為 450 nm 測(cè)定 OD 值。

1.8 Western blotting

除去牽拉板中的生長(zhǎng)培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS 清洗3 次。在每孔中加入80 μl細(xì)胞裂解液，靜置于冰袋上，孵育30 min，用細(xì)胞刮板刮凈，收取細(xì)胞。4℃離心機(jī)上12 000轉(zhuǎn)/分離心20 min。-80℃保存，待測(cè)。采用BCA 法測(cè)定細(xì)胞的總蛋白含量后蛋白變性。然后進(jìn)行8% 的SDS-PAGE 電泳，將目的條帶轉(zhuǎn)至PVDF 膜，使用5% 脫脂牛奶封閉，然后4℃孵育一抗過夜，TBST 清洗后，室溫孵育二抗2 h，ECL 超敏試劑盒顯影，掃描圖片，分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0 軟件，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以M±SD表示。針對(duì)不同牽拉強(qiáng)度和牽拉時(shí)間的數(shù)據(jù)，先采用雙因素方差分析，確定牽拉強(qiáng)度、牽拉時(shí)間是否產(chǎn)生獨(dú)立作用或交互作用，針對(duì)不同因素產(chǎn)生的作用，進(jìn)行Post Hoc 組間兩兩比較，事后檢驗(yàn)采用LSD 法。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)檢測(cè)不同組別與C 組的差異。P＜0.05 為顯著性差異，P＜0.01為非常顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

A：骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞貼壁1d，細(xì)胞體積小，呈圓形，折光性強(qiáng)（40×）；

B：骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞貼壁2d，部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形（40×）；

C：骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞貼壁4d，細(xì)胞增多，細(xì)胞體積變大，部分細(xì)胞呈梭形或多角形（40×）；

D：骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞貼壁6d，細(xì)胞明顯增多，密集呈網(wǎng)狀，相互融合（40×）。

2.2 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定

本實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)1 000 個(gè)細(xì)胞，陰性細(xì)胞數(shù)為24 個(gè)。

細(xì)胞純度（100%）=（1 000-24）/1 000×100%=97.6%

細(xì)胞純度≥95%，達(dá)到的純化的要求。

2.3 不同機(jī)械牽拉強(qiáng)度對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響

如圖2 所示，雙因素方差分析顯示，不同的牽拉強(qiáng)度對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖作用顯著（P＜0.05）。15% 牽拉強(qiáng)度比5% 牽拉強(qiáng)度促增殖效果更好（P＜0.01）。

圖2 機(jī)械牽拉對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響Figure 2. Effects of Mechanical Stretch on the Proliferation of Skeletal Muscle Satellite Cells

與C 組相比，15%S 4 h 組和15%S 6 h 組均能促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖（P＜0.01），5%S 4 h 組和5%S 6 h 組的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖沒有顯著性變化。

2.4 機(jī)械牽拉對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的影響

2.4.1 牽拉結(jié)束即刻Akt、P38、ERK、JNK的變化

如圖 3 所示，不同牽拉強(qiáng)度對(duì) Akt、P38、JNK 的磷酸化作用顯著（P＜0.05）。與5% 牽拉強(qiáng)度相比，15% 牽拉強(qiáng)度活化Akt、P38、JNK 效果更好（P＜0.01）。不同牽拉強(qiáng)度和牽拉時(shí)間均對(duì)ERK 的磷酸化作用顯著（P＜0.01），且兩者之間出現(xiàn)交互作用（P＜0.05），ERK 的磷酸化結(jié)果顯示5%S 6 hvs15%S 6 h（P＜0.01）、5%S 4 hvs15%S 4 h（P＜0.05）、15%S 4 hvs15%S 6 h（P＜0.01）、5%S 6 hvs15%S 4 h（P＜0.01）。

15%S 4 h 組和 15%S 6 h 組的 Akt、P38、ERK、JNK 的磷酸化在牽拉結(jié)束即刻顯著高于C 組（P＜0.01），5%S 4 h 組和 5% 6 h 組的 Akt、P38、ERK、JNK 的磷酸化水平在牽拉結(jié)束即刻與C 組相比未有顯著變化。

2.4.2 牽拉結(jié)束24 h后Myf5和MyoD的蛋白表達(dá)

如圖4，不同的牽拉強(qiáng)度和牽拉時(shí)間對(duì)Myf5 和MyoD 作用不顯著，且牽拉時(shí)間與牽拉強(qiáng)度之間沒有出現(xiàn)交互作用。

如圖 4A，與 C 組相比，15%S 6 h 組 Myf5 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01），5%S 4 h 組、5%S 6 h 組、15%S 4h 組的Myf5 蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性差異。如圖4B，與C 組相比，15%S 4 h 組和15%S 6 h 組的MyoD 的蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01），5%S 4 h 組、5%S 6 h 組的 MyoD 的蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化。

2.4.3 牽拉結(jié)束24 h后Akt、P38、ERK、JNK的變化

不同牽拉強(qiáng)度和牽拉時(shí)間對(duì)Akt 的磷酸化沒有顯著影響，但牽拉強(qiáng)度和牽拉時(shí)間的交互作用顯著（P＜0.05），Akt 的磷酸化結(jié)果顯示 5%S 6 hvs15%S 6 h（P＜0.01）、15%S 4 hvs15%S 6 h（P＜0.05）、15%S 6 hvs5%S4 h（P＜0.01）、5%S 6 hvs15%S 4 h（P＜0.05）。不同牽拉強(qiáng)度和牽拉時(shí)間對(duì)P38、ERK 和JNK 的磷酸化沒有顯著影響，同時(shí)牽拉時(shí)間與牽拉強(qiáng)度之間均沒有出現(xiàn)交互作用。

如圖 5，牽拉結(jié)束 24 h 后，15%S 4 h 組和 15%S 6 h 組的Akt、P38、ERK、JNK 的磷酸化顯著高于C 組（P＜0.01），5%S 4 h 組和 5%S 6 h 組的 Akt、P38、ERK 和 JNK 的磷酸化未有顯著性。

3 分析討論

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是肌源性干細(xì)胞，簡(jiǎn)稱衛(wèi)星細(xì)胞，具有極強(qiáng)的增殖能力。Mauro 等（1961）首次從蛙的脛骨前肌中發(fā)現(xiàn)了位于肌膜與基膜之間的衛(wèi)星細(xì)胞。此后，對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行了很多研究。在成年骨骼肌中，衛(wèi)星細(xì)胞是靜止的，疾病或者損傷等一些刺激，會(huì)激活靜止的衛(wèi)星細(xì)胞，衛(wèi)星細(xì)胞通過不對(duì)稱分裂方式，一部分分裂為活化的衛(wèi)星細(xì)胞，來(lái)修復(fù)肌肉損傷，另一部分則補(bǔ)充衛(wèi)星細(xì)胞池，以保持細(xì)胞池的相對(duì)穩(wěn)定。

有研究表明，一次性力竭運(yùn)動(dòng)能夠激活靜息期的衛(wèi)星細(xì)胞，但不足以誘導(dǎo)其分化（Snijders et al.，2012）；短期的抗阻運(yùn)動(dòng)能夠使衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)目的增加，以及肌纖維肥大（Kadi et al.，2004）；長(zhǎng)期的力量訓(xùn)練能使肌細(xì)胞核和衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)目增加，并且使肌纖維橫截面積增大（Snijders et al.，2009）。這些研究均證實(shí)，運(yùn)動(dòng)可以通過激活骨骼肌中的衛(wèi)星細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)肌肉的肥大。機(jī)械牽拉通過模擬運(yùn)動(dòng)的方式，已在多種細(xì)胞研究中被應(yīng)用，例如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、C2C12 細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨細(xì)胞等。其中，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞對(duì)機(jī)械牽拉反應(yīng)相當(dāng)敏感，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，機(jī)械牽拉能夠?qū)е滦l(wèi)星細(xì)胞活化和增殖。許多可以調(diào)節(jié)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞因子也參與了衛(wèi)星細(xì)胞活化（Thornell et al.，2003；Wang et al.，2006）。有關(guān)機(jī)械牽拉促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞增殖的作用機(jī)制尚未研究透徹，現(xiàn)在的大多數(shù)研究使用成肌細(xì)胞系而不是原代培養(yǎng)的衛(wèi)星細(xì)胞來(lái)探究機(jī)械牽拉在調(diào)節(jié)肌生成中的作用（Chen et al.，2007；Kumar et al.，2004）。本實(shí)驗(yàn)通過體外提取具有干細(xì)胞功能的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，而不是使用被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，能更好的分析關(guān) 于機(jī)械牽拉介導(dǎo)的肌生成的調(diào)節(jié)機(jī)制。

圖3 機(jī)械牽拉結(jié)束即刻骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖相關(guān)通路的變化Figure 3. Changes of Signaling Pathways Associated with the Proliferation of Stretch of Skeletal Muscle Satellite Cells Immediately after Mechanical Stretch

圖4 機(jī)械牽拉結(jié)束24 h后骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的變化Figure 4. Changes of Protein Expressions Associated with the Proliferation of Stretch of Skeletal Muscle Satellite Cells at 24 Hours after Mechanical Stretch

3.1 機(jī)械牽拉對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響

有研究顯示，細(xì)胞對(duì)牽拉的反應(yīng)與牽拉程度有關(guān)，如5% 強(qiáng)度周期性牽拉能促進(jìn)角膜成纖維細(xì)胞的增殖，但是抑制遷移（Suetta et al.，2010）；15% 的強(qiáng)度持續(xù)牽拉膀胱平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞的收縮功能先下降后上升（Honsho et al.，2009）；結(jié)締組織細(xì)胞培養(yǎng)后，給予其 10% 強(qiáng)度、4 h 的牽拉后，可引起細(xì)胞增殖（Hatton et al.，2003）。機(jī)械刺激可以促進(jìn)大鼠肌腱干細(xì)胞的分化，4%、2 Hz 牽拉24 h 促進(jìn)成腱分化，8%、1 Hz 牽拉 24 h 促進(jìn)成骨分化，8%、2 Hz 牽拉48 促進(jìn)成脂肪分化（李跑等，2017）。

圖5 機(jī)械牽拉結(jié)束24 h后骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖相關(guān)通路的變化Figure 5. Changes of Signaling Pathways Associated with the Proliferation of Stretch of Skeletal Muscle Satellite Cells at 24 Hours after Mechanical Stretch

有關(guān)機(jī)械牽拉對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞影響的研究發(fā)現(xiàn)，10% 的周期性牽拉能夠促進(jìn)牛肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖并抑制其分化（Kook et al.，2008）；同樣，史仍飛等（2012）發(fā)現(xiàn)5%、15%、25% 的拉伸度，頻率為1 Hz 的周期性牽拉都能促進(jìn)大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，其中以15% 牽拉強(qiáng)度的增殖效果最為顯著，我們所得到的結(jié)果與上述的結(jié)果相一致。我們通過對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞施加1 Hz、拉伸度為5%和15%、牽拉時(shí)間為4 h 和6 h 的的周期性牽拉，在牽拉結(jié)束24 h 后，采用CCK8 比色法檢測(cè)增殖情況，發(fā)現(xiàn)不同牽拉強(qiáng)度對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖作用顯著，15% 牽拉強(qiáng)度比5% 牽拉強(qiáng)度促增殖效果更好，說明在同牽拉時(shí)間（4 h，6 h）和頻率（1 HZ）的條件下，一定范圍內(nèi)增加牽拉強(qiáng)度，能起到促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的作用。綜上所述，機(jī)械牽拉對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖作用與牽拉強(qiáng)度存在相關(guān)性。15% 的牽拉度可以使肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖能力顯著提高，而5% 的拉伸度對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞沒有促增殖作用。有其它研究發(fā)現(xiàn)5% 的拉伸度能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，這與我們得出的結(jié)論不一樣，推測(cè)可能是由于機(jī)械牽拉對(duì)細(xì)胞的影響會(huì)根據(jù)細(xì)胞種類、種屬來(lái)源的不同而有所不同（Bullard et al.，2007；Zhao et al.，2016）。

3.2 機(jī)械牽拉可能通過調(diào)控MyoD 和Myf5 的表達(dá)來(lái)促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖

骨骼肌的生成依賴生肌調(diào)節(jié)因子（MRFs）家族的參與。Myf5 和MyoD 是MRFs 中的成員，在肌肉早期發(fā)育、形成過程中起著重要的作用（陶志云等，2012）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)敲除MyoD 基因，出生的小鼠會(huì)有正常肌肉的形成，當(dāng)同時(shí)去除MyoD 和Myf5 時(shí)，小鼠無(wú)肌肉形成（Rudnicki et al.，1994）。Myf5 是參與肌細(xì)胞增殖、分化、肌纖維形成過程中最早表達(dá)的因子，Myf5 一旦被激活，MRFs 家族的其他因子將相繼被激活，整個(gè)肌肉發(fā)育過程才能完整而順利的進(jìn)行下去。Cooper 等（1999）通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，小鼠骨骼肌再生時(shí)，肌衛(wèi)星細(xì)胞激活早期MyoD 基因，在所有增殖的肌衛(wèi)星細(xì)胞中，MyoD 也都顯著表達(dá)，因此在成體骨骼肌中，MyoD 被認(rèn)為是衛(wèi)星細(xì)胞激活的一個(gè)很好的標(biāo)志。活化的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中會(huì)有MyoD 和Myf5 的表達(dá)，在衛(wèi)星細(xì)胞增殖的過程中，MyoD 和Myf5 的蛋白表達(dá)增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的牽拉強(qiáng)度和牽拉時(shí)間對(duì)Myf5 和MyoD作用不顯著，說明MyoD 和Myf5的蛋白表達(dá)對(duì)牽拉時(shí)間和牽拉強(qiáng)度的變化沒有依賴性。拉伸度為15%，在牽拉4 h 和6 h后24 h 時(shí)，MyoD 蛋白表達(dá)顯著增高，說明衛(wèi)星細(xì)胞被大量激活，進(jìn)入增殖狀態(tài)，這與CCK8 測(cè)得的結(jié)果相符；Myf5 的蛋白表達(dá)在拉伸度為15%，牽拉6 h 也顯著增高。而拉伸度為15%，牽拉4 h未增高，這與CCK8結(jié)果并不統(tǒng)一，本實(shí)驗(yàn)選取檢測(cè)Myf5蛋白表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)是牽拉結(jié)束24 h，并未檢測(cè)牽拉結(jié)束24 以內(nèi)以及牽拉結(jié)束24 以后Myf5 蛋白表達(dá)的變化，推測(cè)出現(xiàn)此種結(jié)果的原因可能是Myf5 的蛋白表達(dá)處于升高階段，還未到達(dá)峰值，具體原因需通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)獲取。

3.3 機(jī)械牽拉可能通過調(diào)控Akt、P38、ERK、JNK 通路來(lái)調(diào)節(jié)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖

PI3K/Akt/mTOR 通路是影響蛋白變化的關(guān)鍵通路，并且參與機(jī)械牽拉引起細(xì)胞增殖的過程。Akt 是PI3K 下游的關(guān)鍵效應(yīng)分子，Akt 被激活后，磷酸化水平升高，進(jìn)而激活下游的 mTOR，促進(jìn)肌肉的合成（Rommel et al.，2001）。一定程度的機(jī)械牽拉能夠通過活化Akt 的途徑來(lái)促進(jìn)心肌的肥大；有研究表明，10% 的拉伸度能顯著提高血管平滑肌的Akt 活性，并且這種變化對(duì)時(shí)間有依賴性（Won et al.，2013）；相同的，15% 的拉伸度牽拉主動(dòng)脈平滑肌，持續(xù)6 h，能激活 PI3K/Akt 通路（Liu et al.，2015）。Akt 的活化被證實(shí)與肌肉的存活和凋亡密切相關(guān)，機(jī)械牽拉引起骨骼肌的質(zhì)量改變也是通過PI3K/Akt/mTOR 這條通路介導(dǎo)的（Chen et al.，2014）。對(duì)C2C12細(xì)胞進(jìn)行周期性牽拉僅30 min，就能引起mTOR 下游蛋白p70S6K 的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)肌肉的合成（Alexander et al.，2004）。由此可以推測(cè)，機(jī)械牽拉促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖作用可能是通過PI3K/Akt/mTOR/p70S6K 這條通路介導(dǎo)的。

MAPK（絲裂素活化蛋白激酶）通路是參與細(xì)胞應(yīng)激和損傷反應(yīng)的主要信號(hào)通路，能將多種細(xì)胞外刺激產(chǎn)生的信號(hào)從細(xì)胞膜外傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞的增殖、分化和對(duì)外環(huán)境應(yīng)激中起著非常重要的作用（Amiram et al.，2013）。 在哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要有 ERK 通路、JNK 通路和P38 通路，這些信號(hào)的傳導(dǎo)對(duì)細(xì)胞調(diào)節(jié)具有重要的影響。ERK 通路是MAPK 家族中研究最早的通路，許多細(xì)胞外刺激可以激活ERK 通路，以Ras/Raf/MEK/ERK 這條通路最為常見，活化后的ERK 移動(dòng)到細(xì)胞核，活化眾多與細(xì)胞功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。JNK 通路可被多種因子激活，例如，LPS、TNF-α、JNK 可從胞漿進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)（Weston et al.，2002）。P38 通路被認(rèn)為是 MAPK 家族中最經(jīng)典的通路，P38 一般位于靜止細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核，被激活后形成pP38，進(jìn)而激活多種轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)細(xì)胞表面基因表達(dá)，加速蛋白合成和細(xì)胞骨架重構(gòu)（Chen et al.，2011）。

機(jī)械牽拉能夠通過激活細(xì)胞內(nèi)的MAPK 通路，來(lái)促進(jìn)蛋白的合成。15% 拉伸度的機(jī)械牽拉可以激活C2C12 細(xì)胞中 P38、ERK、JNK 的磷酸化（Nakai et al.，2010）；人的成纖維細(xì)胞接受10% 的機(jī)械牽拉后，P38 的活化顯著增高；有關(guān)大鼠平滑肌的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，20% 的拉伸度牽拉5～10min就可以使 P38 和 JNK 的活性顯著升高（Xu et al.，2012）；對(duì)牛內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行周期性拉伸，JNK、ERK 和P38 的磷酸化水平都顯著升高（Kito et al.，2000）。 這些結(jié)果都表明，MAPK 家族在機(jī)械牽拉調(diào)控的細(xì)胞增殖中具有重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)中，在牽拉結(jié)束即刻，不同牽拉強(qiáng)度對(duì)Akt、P38、JNK 的磷酸化作用顯著。與5% 牽拉強(qiáng)度相比，15%牽拉強(qiáng)度活化Akt、P38、JNK 效果更好，說明在同牽拉時(shí)間（4 h，6 h）和頻率（1 HZ）的條件下，一定范圍內(nèi)增加牽拉強(qiáng)度能使Akt、P38、JNK 活化增加；不同牽拉強(qiáng)度和牽拉時(shí)間均對(duì)ERK 的磷酸化作用顯著，推測(cè)ERK 通路的活化對(duì)牽拉強(qiáng)度與牽拉時(shí)間的變化均有依賴性，在同牽拉時(shí)間（4 h，6 h）和頻率（1 HZ）的條件下，一定范圍內(nèi)增加牽拉強(qiáng)度，或者同牽拉強(qiáng)度（5%，15%）和頻率（1 HZ）的條件下，一定范圍內(nèi)延長(zhǎng)牽拉時(shí)間，可能使ERK 的活化增加。5%S 4 h 組和 15%S 6 h 組的 Akt、P38、ERK、JNK 的磷酸化顯著高于C 組。由此可以看出，在牽拉結(jié)束即刻這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi)與增殖相關(guān)的部分蛋白磷酸化就已升高，根據(jù)牽拉結(jié)束 24 h 后，15%S 4 h 組和 15%S 6 h 組的 Akt、P38、ERK、JNK 的磷酸化依然顯著高于 C 組的結(jié)果，可推測(cè)，與骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖相關(guān)的磷酸化蛋白在牽拉即刻就可開始升高，部分蛋白的磷酸化可能持續(xù)增高直到牽拉結(jié)束24 h 后。當(dāng)然也有截然不同的研究結(jié)果，通過培養(yǎng)大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞后進(jìn)行牽拉發(fā)現(xiàn)，機(jī)械牽拉對(duì)與細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)的ERK 通路無(wú)關(guān)，而與P38 通路和 JNK 通路密切相關(guān)（Nguyen et al.，2000）。機(jī)械牽拉使牛的肌衛(wèi)星細(xì)胞中ERK 的磷酸化水平顯著增高，而P38的磷酸化水平呈降低的趨勢(shì)。這些都有可能是由于細(xì)胞的類型或者是種屬的不同，而產(chǎn)生不同的結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，15% 拉伸度牽拉4 h 和6 h，均可以骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，在牽拉結(jié)束即刻Akt、P38、ERK、JNK 的活性已經(jīng)顯著升高，并且在牽拉結(jié)束24 h 后，Akt、P38、ERK、JNK 的活性依然呈現(xiàn)顯著升高的狀態(tài)。以往的研究只是對(duì)選取某個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行研究，而本研究選取了牽拉結(jié)束即刻和牽拉結(jié)束24 h 后這2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較，能更好的探究與骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖相關(guān)的通路蛋白的變化，這也是本文的創(chuàng)新點(diǎn)。由于條件限制，本研究并未使用各個(gè)通路蛋白的特異性抑制劑進(jìn)行研究，也沒有檢測(cè)各個(gè)通路下游蛋白的表達(dá)，因此只能得出初步結(jié)論。

4 結(jié)論

1）15% 的拉伸度，牽拉4 h 和6 h 可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖。

2）機(jī)械牽拉可能是通過激活A(yù)kt、P38、ERK、JNK 這些通路來(lái)促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的。