童英，段小花，楊麗萍，張光云，陳普

云南中醫(yī)藥大學/云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點實驗室，昆明650500

急性心肌梗死是一種由心肌缺血造成的心臟病，臨床上常采用再灌注治療來改善梗死區(qū)的血液循環(huán)，但也往往導致心肌缺血再灌注損傷(MIRI)，嚴重威脅心肌梗死患者的生存和預后。MIRI發(fā)生的始發(fā)環(huán)節(jié)普遍認為是三磷酸腺苷(ATP)缺乏，而ATP由線粒體通過三羧酸循環(huán)(也稱檸檬酸循環(huán)、Krebs循環(huán))和氧化磷酸化來合成，且線粒體提供了維持心肌細胞正常生理功能所需的95%的能量，這就凸顯出線粒體在心肌細胞中的地位，只有維持其結構和功能的完備性，心肌細胞才能進行正常的生理活動。因此，線粒體是心肌細胞命運的決定性因素，其損傷是MIRI的關鍵環(huán)節(jié)?，F(xiàn)就線粒體功能障礙在MIRI發(fā)病中的作用及靶向治療研究進展綜述如下，以期為MIRI發(fā)病機制和臨床治療提供參考。

1 線粒體的功能

線粒體是存在于真核生物中具有脂質雙分子層膜結構的細胞器，從外到內分別為外膜、膜間隙、內膜和基質。線粒體外膜平滑、通透性較高，可介導多種蛋白運輸；內膜向內凹陷形成嵴，線粒體的表面積增加，從而為膜依賴型的反應(例如氧化磷酸化)提供了較大的面積，呼吸鏈蛋白、分裂與融合蛋白均在此；膜間隙中含有線粒體通透性轉換孔(mPTP)，其開閉狀態(tài)與線粒體功能是否正常有關。線粒體的主要功能有：①合成ATP。線粒體既是細胞的“能量工廠”，也是ATP合成的主要場所，為細胞生長和增殖提供95%能量來源[1]。②維持Ca2+穩(wěn)態(tài)。線粒體Ca2+的吸收、儲存及釋放通過內膜中電化學質子梯度來調節(jié)，維持著細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)，同時Ca2+還介導線粒體內多種酶，因此，Ca2+濃度會影響線粒體能量代謝。③產(chǎn)生活性氧(ROS)。ROS主要產(chǎn)生于線粒體內，是線粒體合成ATP過程中的副產(chǎn)物，在氧化應激和細胞調亡中起著重要作用。④調控細胞凋亡。線粒體是細胞凋亡的調控中心。線粒體受損時，會釋放細胞色素c(Cyt c)、Caspase-3等凋亡相關因子，激活細胞凋亡程序，進而促進細胞死亡。⑤介導線粒體自噬。線粒體可通過自噬選擇性地識別和清除受損的線粒體[2]，線粒體自噬避免受損線粒體對鄰近線粒體和細胞造成損害，有助于對線粒體的質量控制及維持線粒體的正常功能。⑥調節(jié)mPTP開合。mPTP一般只在病理條件下開放。當線粒體受損或Ca2+超載時mPTP則會開放，從而造成細胞凋亡和細胞壞死。

1.1 合成ATP 第一階段：糖酵解(以一分子葡萄糖舉例，下同)。糖酵解在胞質中進行，即一分子葡萄糖在厭氧條件下轉化為二分子丙酮酸，并產(chǎn)生2 ATP和2[NADH+H+](還原型輔酶Ⅰ)。第二階段：三羧酸循環(huán)。糖酵解產(chǎn)生的二分子丙酮酸在線粒體基質上繼續(xù)氧化脫羧形成二分子乙酰輔酶A，其中一分子乙酰輔酶A和一分子草酰乙酸反應合成一分子檸檬酸，經(jīng)過三羧酸循環(huán)，再生成一分子草酰乙酸與剩下一分子乙酰輔酶A反應，開始又一次循環(huán)，共產(chǎn)生2 ATP、8 [NADH+H+]和2 FADH2(還原型黃素二核苷酸)，這一過程不需要O2參與。第三階段：氧化磷酸化。這一階段在線粒體內膜進行，需要O2參與。線粒體呼吸鏈(ETC)定義為在生物氧化過程中，通過一系列的遞氫反應和遞電子反應，成對氫原子從代謝物上脫下來，按固定順序傳遞給氧生成水，并伴隨能量生成的過程。ETC的作用代表線粒體最基本的功能。ETC涉及多個亞基復合物，包括復合物Ⅰ、復合物Ⅱ、復合物Ⅲ和復合物Ⅳ，即NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、CoQ-細胞色素c還原酶、細胞色素c氧化酶，以及移動電子載體泛醌(CoQ)和Cyt c。NADH和FADH2分別提供電子給復合物Ⅰ和Ⅱ，然后轉移至CoQ，電子通過CoQ被引導至復合物Ⅲ，然后Cyt c轉移電子至復合物Ⅳ，最后將電子轉移到1/2 O2[3]。呼吸鏈中質子跨膜轉運使得大量的質子從基質轉運到膜間隙，造成內膜外側質子濃度高于內膜內測，從而建立了質子梯度并形成了電化學梯度，即pH梯度和跨膜電勢差，隨后，質子順梯度跨膜內流，經(jīng)復合物V(ATP合酶)作用，最終生成H2O和CO2等終末產(chǎn)物，并伴隨能量釋放，二磷酸腺苷(ADP)被磷酸化生成ATP。至此，完成氧化磷酸化的全過程，這就是米歇爾于1961年提出的化學滲透理論[4]。合成的ATP可用于生物過程，例如肌肉收縮、神經(jīng)沖動傳導、類固醇和血紅素的生物合成、鈣和鐵穩(wěn)態(tài)、程序性細胞死亡等。

1.2 維持Ca2+穩(wěn)態(tài) 不同刺激(例如營養(yǎng)素、激素、神經(jīng)遞質等)有著不一樣的能量需求，從而產(chǎn)生相對應的Ca2+濃度，進而刺激能量產(chǎn)生以維持各自的能量需求[5]。Ca2+不會單獨流過細胞膜和線粒體膜，它的轉運主要依賴于Na+，并且維持Ca2+穩(wěn)態(tài)的主要調節(jié)劑是Na+/Ca2+交換劑(NCX)。NCX催化跨質膜的3個Na+和1個Ca2+離子的雙向流變交換，即以Ca2+外流/Na+流入模式(正向模式)或Ca2+內流/Na+流出模式(反向模式)運行[6]。線粒體Ca2+的濃度與其能量代謝、膜的通透性、細胞存活和死亡等密切相關[7]。

1.3 產(chǎn)生ROS ROS主要來源于線粒體，包括自由基和過氧化氫。ROS產(chǎn)生的主要位點是呼吸鏈復合物Ⅰ，它包含ROS的兩個生化因子：黃素單核苷酸位點(IF位)和泛醌結合位點(IQ位)。除呼吸鏈復合物外，mPTP的開放也會釋放ROS，并累積潛在毒性的ROS，在較高的ROS水平下，mPTP又會大幅增加ROS的釋放，這種現(xiàn)象稱為“ROS誘導的ROS釋放”(RIRR)[8]。過量的ROS會導致許多病理過程，包括衰老、細胞凋亡[9]、脂質膜、蛋白質以及核酸受損。

1.4 調控細胞凋亡 細胞凋亡是一種受基因調控，具有自我破壞性的程序性細胞死亡，是一種主動性死亡過程，與被動死亡的壞死是兩種基本不同的死亡形式，其中調控細胞凋亡的核心是Caspase半胱氨酸蛋白酶家族，Caspase-3是其主要執(zhí)行者，被稱為“死亡蛋白酶”[10]。當線粒體釋放Cyt c到胞漿中后，在三磷酸脫氧腺苷(dATP)和ATP存在條件下與凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf1)相互作用，聚合形成凋亡小體，導致上游因子Caspase-9活化，然后，通過級聯(lián)反應激活Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等下游因子，使凋亡不可避免，最終導致細胞死亡[11]。同時，Bcl-2家族也是一種常見的凋亡控制基因[12]，Bcl-2家族中主要包括：抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Bak。Bax和Bcl-2兩者之間具有拮抗作用，即當Bcl-2的表達下降時，Bax和Bak表達反而上升，此時細胞凋亡加速；當Bcl-2表達升高時，Bax和Bak表達反而會降低，此時細胞凋亡受到抑制。mPTP也參與到細胞凋亡過程中，當其開放延長時，Bax和Bak使膜通透性增加，誘導線粒體碎裂和Cyt c釋放，激活級聯(lián)反應，并導致細胞凋亡[13～15]。

1.5 介導線粒體自噬 線粒體自噬是一種受各種因子調節(jié)的識別和清除功能紊亂線粒體的過程，主要通過Pink1/Parkin介導[16，17]。蛋白激酶Pink1提示受損的線粒體中膜電位的喪失，該蛋白具有線粒體靶向序列，正常條件下會在線粒體內部保持降解狀態(tài)，但是當線粒體膜電位降至一定水平以下時，Pink1無法從線粒體外膜轉入線粒體內部，降解停止。之后，Pink1在外膜積累，在這里它從細胞質中補充E3泛素連接酶Parkin，進而通過泛素化和降解線粒體外膜蛋白Miro來觸發(fā)線粒體自噬[18]。此外，線粒體自噬還存在Bnip3、FUNDC1等通路[19]。自噬是一個質量控制的過程，是維持一個健康的線粒體網(wǎng)絡所必需的，這一過程還與線粒體分裂和融合有關，它們之間的平衡維持著線粒體正常功能[20，21]。

1.6 調節(jié)mPTP開合 線粒體膜的通透性靠mPTP的開啟和關閉來調節(jié)。mPTP是位于線粒體膜間隙的非特異性高導電性通道，是一種多蛋白復合物，維持內外離子的相對穩(wěn)定性，對保持穩(wěn)定的電勢差和膜電位起著至關重要的作用[22]。生理情況下mPTP是處于關閉狀態(tài)，它控制線粒體氧化磷酸化來調節(jié)能量代謝。mPTP的開放使得小于1.5 kDa的分子非選擇性滲透進入線粒體內膜，從而破壞了線粒體膜電位，與氧化磷酸化解偶聯(lián)并導致ATP缺乏和細胞死亡。mPTP的另一個重要作用是使線粒體膜通透性增加，使線粒體腫脹，并釋放促凋亡因子，激活細胞凋亡程序，最終導致細胞死亡[23]。

2 線粒體功能障礙及其在MIRI發(fā)病中的作用

心肌細胞里富含大量的線粒體，心臟維持正常的生理功能需要消耗大量能量，而能量的供給依賴于心肌細胞中的線粒體，因此，只有保持線粒體結構和功能的完整性才能保證心肌細胞的正常生理功能。心肌缺血時，線粒體受到損傷，再灌注期間，線粒體結構和功能遭到進一步破壞，使存活的心肌細胞繼續(xù)減少，出現(xiàn)MIRI。MIRI出現(xiàn)的原因可能如下：ATP合成減少，能量不足，心臟就無法維持正常生理功能，壞死面積進一步加大；mPTP開放會加重Ca2+和ROS的積累，并且Ca2+和ROS的超負荷可加劇線粒體損傷，放大線粒體功能障礙并導致能量代謝紊亂；凋亡信號通路的激活和線粒體過度自噬會致使大量正常的心肌細胞死亡。線粒體功能的這種降低會觸發(fā)惡性循環(huán)，影響再灌注的治療效率。

2.1 ETC受損和能量代謝障礙在MIRI發(fā)病中的作用 MIRI發(fā)生的始發(fā)環(huán)節(jié)普遍認為是能量代謝障礙。當心肌細胞處于缺血狀態(tài)時，心肌能量代謝中大部分有氧氧化轉變?yōu)樘墙徒馔緩剑洚a(chǎn)生的少量ATP逐漸成為維持心肌細胞生命活動的唯一能量來源[24]，糖酵解使細胞內的乳酸水平增加，細胞進而發(fā)生代謝性酸中毒，而酸中毒又會抑制糖酵解，加重能量供應不足。再灌注過程中，對糖酵解的抑制作用會減弱，酸中毒加深。同時，大量的線粒體受損，ETC受損，使即使恢復了有氧再灌注，線粒體也不能有效地進行有氧氧化產(chǎn)能，導致恢復再灌注的相當一段時間內糖酵解仍然是主要產(chǎn)能途徑，但糖酵解產(chǎn)生的ATP遠遠不夠滿足心肌細胞的正常需求，導致心肌細胞的損傷甚至凋亡[25]。

2.2 線粒體Ca2+超載在MIRI發(fā)病中的作用 心肌缺血時，體內主要產(chǎn)能途徑變成糖酵解途徑，乳酸水平增加引起細胞酸中毒，pH值下降(<7.0)。再灌注期間，細胞外pH值迅速恢復，并在細胞內外形成一個跨膜pH梯度，激活了Na+/H+交換蛋白(NHE)，H+轉運出細胞，細胞內Na+大量增加。同時，糖酵解產(chǎn)生的ATP遠遠不夠滿足心肌細胞的正常需求，Na+-K+-ATP酶活性受到抑制，Na+不能及時從細胞內排出，導致細胞內Na+超載，從而激活Na+/Ca2+交換機制的反向模式，大量Ca2+內流，最終導致Ca2+超載。此外，缺血再灌注時ATP生成不足和線粒體膜電位恢復分別導致細胞膜上Ca2+-ATP酶(Ca2+泵)活性降低和線粒體鈣單向轉運蛋白(MCU)的激活，加重了細胞內Ca2+超載[26]，從而加劇線粒體損傷，最終導致心肌細胞死亡。

2.3 線粒體ROS增多和細胞凋亡在MIRI發(fā)病中的作用 線粒體不僅是細胞內ROS的主要來源，也是細胞凋亡的調控中心。在心肌缺血再灌注初始幾分鐘，ROS會爆發(fā)性增加，引起氧化應激和脂質過氧化反應，而不正常的氧化應激會導致ETC受損所致的ROS絕對增加以及抗氧化酶活性降低所致的ROS相對增多，造成惡性循環(huán)。此時，線粒體既無法為機體提供充足能量，產(chǎn)生的ROS還會進一步損傷線粒體，造成心肌細胞氧化損傷、mPTP持續(xù)開放，釋放Cyt c，進而活化Caspase-3等下游因子，細胞凋亡程序被激活，細胞裂解，最終被吞噬。

2.4 線粒體自噬在MIRI發(fā)病中的作用 線粒體自噬是一種受各種因子調節(jié)的識別和清除功能紊亂線粒體的過程，是一個質量控制的過程，用以保持線粒體功能的完整性。正常條件下，機體通過啟動線粒體自噬來清除受損的心肌細胞，以保護鄰近正常的心肌組織。但是，過度的線粒體自噬會將正常的線粒體降解并加劇對心肌細胞的損害[27]。再灌注發(fā)生時，ROS大量產(chǎn)生和Ca2+超載等會造成線粒體損傷，進而過度激活自噬，引起大量不必要心肌細胞進一步損傷。

2.5 線粒體mPTP開放在MIRI發(fā)病中的作用 mPTP的不可逆開放是MIRI發(fā)展的最后階段[28]，它在心肌細胞死亡中起著關鍵作用。mPTP在急性心肌缺血期間保持關閉狀態(tài)，僅在再灌注的前幾分鐘內開放，膜通透性增加，允許通常無法跨過內膜的小分子非選擇性通過，從而進一步增加了線粒體基質中的滲透壓，導致更多的小分子物質進入線粒體內膜，形成惡性循環(huán)，促使線粒體腫脹甚至破裂，線粒體功能出現(xiàn)障礙，同時，Bcl-2家族成員中促凋亡蛋白Bax和Bak誘導Cyt c等因子向胞漿釋放，通過一系列級聯(lián)反應激活調亡程序，導致細胞調亡[25，29]。Ca2+超載、ROS暴增、pH值變化等均會導致mPTP開放[30]，這些因素通過激活mPTP的重要組分親環(huán)素D(Cyp D)，延長mPTP開放時間，使電化學質子梯度潰散，與氧化磷酸化解偶聯(lián)，ATP合成停止，隨之發(fā)生細胞壞死。另一方面，mPTP開放導致的受損線粒體成為線粒體自噬的標記，通過Pink1/Parkin途徑使正常心肌細胞死亡。因此，線粒體功能障礙引起的不良反應之間相互交叉重疊，最終會導致mPTP的過度開放，加重MIRI的程度或進程。

3 MIRI患者線粒體功能障礙的靶向治療

MIRI防治有缺血預適應、缺血后處理、遠程缺血預適應、藥理性預適應、藥物后處理等方法，但在臨床上療效不佳，隨著醫(yī)學的進步，研究者發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙是MIRI發(fā)生的主要因素，線粒體是MIRI心肌保護中一個有吸引力的靶點,于是線粒體靶向治療MIRI逐漸開始從基礎走向臨床。線粒體靶向治療是指藥物針對受損線粒體特定部位的一種治療方法，具有抵消線粒體功能障礙引起的不良事件的作用。急性心肌缺血時，多種因素引起線粒體受損，再灌注治療后，線粒體功能進一步遭到破壞，并由此引發(fā)了MIRI。所以，通過線粒體靶向治療，給予靶向藥物，抑制線粒體功能障礙引起的不良事件，使其從病理狀態(tài)恢復正常，減輕線粒體損傷，從而改善心肌細胞活力和減輕MIRI，加強心肌梗死的治愈率，具有極大的臨床意義和研究價值。

3.1 靶向線粒體ATP通道藥物 尼克地爾是線粒體KATP通道敏感性開放劑，它通過激活KATP通道，使大量K+進入線粒體，激活ETC，ATP合成增加的同時抑制ATP消耗，并保存ATP，減少心肌梗死的范圍。同時，尼克地爾還可以降低Ca2+超載、抑制ROS爆發(fā)，保護MIRI[31]。二氮嗪是線粒體KATP通道特異性開放劑，也可使大量K+內流，線粒體基質容積增加，使ATP合成增加，減輕Ca2+超載以及使ROS合成減少，最終達到保護細胞保護作用[32]。

3.2 靶向線粒體F1F0ATP水解酶藥物 MIRI期間，線粒體F1F0ATP水解酶含量上升，導致線粒體內大量ATP被無用消耗，而通過使用線粒體F1F0ATP水解酶抑制劑—BMS-199264，達到抑制ATP減少的作用。在體外實驗表明，BMS-199264具有明顯的大鼠心肌細胞保護作用，具有較好的研究前景[33]。

3.3 靶向線粒體Ca2+藥物 MCU是一種位于線粒體內膜的蛋白質，負責線粒體Ca2+的吸收，MCU抑制劑可以降低MCU的表達，使線粒體Ca2+含量降低，致使Ca2+依賴的細胞凋亡減弱[34]。已普遍使用MCU抑制劑有RuR和Ru360[35]。NCX反向轉運抑制劑和NHE抑制劑也對降低Ca2+超載有著良好效果。雷帕霉素通過激活NCX的正向模式，降低Ca2+濃度，抵抗MIRI。NHE抑制劑KR-32570、HOE694等則通過抑制Na+在細胞內的積累，從而激活NCX的正向模式，降低Ca2+濃度，從而發(fā)揮心臟保護效應[26]。

3.4 靶向線粒體ROS藥物 線粒體是ROS的主要靶向位點，因此，清除ROS有助于減少心肌細胞死亡數(shù)目。目前，最具有研究意義的線粒體靶向抗氧化劑藥物為以三苯基膦(TPP)為基礎的線粒體抗氧化遞送系統(tǒng)，如Vit E、泛醌等。TPP是一種親脂性陽離子，抗氧化劑與TPP的共價鍵結合后，被線粒體迅速吸收，使抗氧化劑在線粒體內大量積累。Vit E抑制線粒體過氧化氫生成，減輕線粒體的氧化損傷；泛醌進入線粒體基質后，被迅速降解為抗氧劑泛醇，減少ROS的積累，抑制脂質過氧化反應[36]。此外，臨床也常用SS家族的肽遞送系統(tǒng)來遞送藥物至細胞的適當區(qū)域，以防止藥物在血液循環(huán)中被清除。白藜蘆醇(RSV)是一種強有力的活性氧清除劑，與SS肽結合，同時因SS肽與線粒體穿透肽的強結合親和力，進入線粒體內，及時清除多余的ROS，使其含量保持在正常水平[37]。

3.5 靶向mPTP藥物 mPTP特異性抑制劑通過抑制mPTP的持續(xù)性開放，維持線粒體的完整性，以改善MIRI。Cyp D為核基因肽基脯氨酰異構酶F(PPIF)編碼的大分子蛋白，是mPTP的關鍵組分和正調節(jié)劑。因此，mPTP抑制劑主要是Cyp D抑制劑，包括大部分的靶向抑制Cyp D的抑制劑和少數(shù)的Cyp D非依賴性抑制劑。環(huán)孢菌素A(CsA)是一種免疫抑制劑，通過結合高度保守的脯氨酰異構酶的凹槽，靶向抑制Cyp D，使其位點失去活性來抑制mPTP的開放。Cyp D非依賴性抑制劑有肉桂酸和異惡唑等[38，39]。

總之，諸多研究證明線粒體功能障礙與MIRI密切相關，線粒體結構和功能正常與否關乎心肌細胞是否能正常進行生命活動，因此，對線粒體的相關研究成為MIRI的研究熱點。同時，線粒體靶向治療成為MIRI治療的發(fā)展方向，通過抑制相關通路改善線粒體功能障礙來減輕MIRI，為MIRI提供了研究方向。