楊 敏 李文云 馬 莉 解 靜 李凌飛 田 洋1,③

(1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 云南昆明650201;2 國家辣木加工技術(shù)研發(fā)中心 云南昆明650201)

結(jié)腸癌是發(fā)生在結(jié)腸部位的消化道常見惡性腫瘤，也是世界四大腫瘤之一［1]。根據(jù)世界流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告，結(jié)腸癌發(fā)病率最高的地方是北美、西歐、澳大利亞、新西蘭等地［2]。近年來，隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，中國結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年上升，流行病學(xué)研究表明，除了遺傳因素外，結(jié)腸癌的病因與飲食密切相關(guān)。研究表明，食用紅肉與結(jié)直腸癌的發(fā)生呈正相關(guān)，食用魚、蔬菜和水果與結(jié)直腸癌的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)［3]。目前結(jié)腸癌的主要治療方法是手術(shù)和化療，手術(shù)創(chuàng)傷較大且有復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，化療藥物副作用較大，可抑制人體免疫功能，對人體功能造成損害。近年來，開發(fā)天然的腫瘤預(yù)防、干擾物質(zhì)尤其受到重視，其中最有希望的是一類來源于植物活性成分中的多酚類物質(zhì)［4]，植物多酚不僅具有抗炎殺菌的作用，還與癌癥低發(fā)有密切聯(lián)系。多酚抗癌作用機(jī)理主要與其抗氧化、抗突變、調(diào)節(jié)免疫、抑制致癌物導(dǎo)致的癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制致癌基因表達(dá)、調(diào)控信號傳導(dǎo)及影響機(jī)體酶活性等有關(guān)［5-8]。

辣木（Moringa oleiferaLam）為辣木科辣木屬多年生熱帶落葉喬木，耐旱能力強(qiáng)，廣泛種植于亞洲、非洲的熱帶及亞熱帶地區(qū)［9]。辣木又稱為“奇跡之樹”，是一種含有豐富營養(yǎng)成分且極具藥用價(jià)值的植物，可作為增強(qiáng)體力、降糖降脂、抑制病菌、抗癌防癌等天然的植物來源食品［10]。辣木葉是辣木中富含多酚、黃酮、蛋白質(zhì)及微量元素的部位。中國衛(wèi)生部門于2012年11月12日在《中華人民共和國衛(wèi)生部2012年第十九號公告》中將辣木葉批準(zhǔn)為新資源食品［11]。辣木葉含有大量抗氧化活性物質(zhì)，Siddhuraju 等［12]發(fā)現(xiàn)，辣木葉的醇提物抗氧化活性達(dá)66.8%，具有良好的自由基清除能力。另外，辣木葉中的抗氧化組分也可以抑制自由基引起的氧化低密度脂蛋白的產(chǎn)生，達(dá)到降血脂和防止動(dòng)脈粥樣硬化的作用。同時(shí)辣木葉還能抑制人體腫瘤細(xì)胞增殖，例如Tiloke 等［13]發(fā)現(xiàn)，辣木葉提取物可以抑制肺癌細(xì)胞A549 的生長。Berkovich 等［14]發(fā)現(xiàn)，辣木葉提取物通過干預(yù)NF-κB信號通路抑制了胰腺癌細(xì)胞的生長，這主要是由于辣木葉提取物中富含多酚類化合物。

辣木葉多酚是辣木葉中所含多元酚類的總稱。研究發(fā)現(xiàn)，辣木葉多酚的體外抗氧化活性是同等質(zhì)量濃度VC 的75%以上［15]，除具有較強(qiáng)的抗氧化活性外，辣木葉多酚還有抑菌、消炎、抗癌、抗菌、抗病毒、保護(hù)肝臟、降血壓等多種醫(yī)療價(jià)值和生物功效［16-18]。Singh 等［19]通過高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，辣木葉中含有沒食子酸、綠原酸、鞣花酸、阿魏酸、山奈酚、槲皮素、香蘭素等酚類單體成分。Kashiwada 等［20]從5 kg 辣木葉中分離出了10 種活性化合物成分，其中含有異槲皮苷（3.5 g）、槲皮素2 種衍生物（1.16 g）、山奈酚（364 mg）、綠原酸（120 mg）等，這些酚類單體均具有抑制腫瘤、抗炎消毒等作用。

雖然辣木提取物具有多種功效，但以往的研究主要涉及辣木及其提取物的抗氧化活性或功能食品開發(fā)。關(guān)于辣木葉醇提物中多酚類物質(zhì)及其含有的主要酚類單體對人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用尚未見報(bào)道。因此本研究通過MTT 細(xì)胞活率測定、細(xì)胞克隆形成及劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)及檢測凋亡蛋白的表達(dá)，探究辣木多酚提取物及其主要酚類單體化合物在結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞中的抗癌作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

辣木葉粉購于云南天佑科技開發(fā)有限公司；人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、人結(jié)腸正常上皮細(xì)胞系NCM460 均購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細(xì)胞庫。3-（4，5-二甲基噻唑）-2，5-二苯基四唑溴化物噻唑藍(lán)（MTT）、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自北京索萊寶科技有限公司；F-12 高糖培養(yǎng)基、DMEM 高糖培養(yǎng)基均購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Thermo Scientific 公司；槲皮素、異槲皮素、蘆丁、山奈酚、綠原酸、金絲桃苷均購自美國Sigma-Aldrich 公司，純度≥99%；Annexin V/PIFITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體Bax、Bcl-2均購自美國Cell Signaling Technology公司；抗體Tublin購于英國Abcam公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD 型超凈工作臺（安徽安泰空氣技術(shù)有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（蘇州貝茵醫(yī)療器械有限公司）；Countess 細(xì)胞計(jì)數(shù)器（美國Thermo Scientific 公司）；XDS-800C 型倒置電子顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；全波長酶標(biāo)儀（BioTek Instruments 公司）；SC3616 型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；XMTD203 型恒溫水浴鍋（中國江蘇太倉華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；電泳槽電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 辣木葉多酚提取

參考趙謀明等［21]、沈慧等［22]的方法，采用超聲輔助乙醇提取法從辣木葉中提取多酚。先將辣木葉粉碎，過40 目篩；稱取3 份辣木葉干粉，每份30 g，按照1∶10 的料液比體系分別加入體積分?jǐn)?shù)為20%、50%、80 %的乙醇溶液，在溫度60℃，超聲功率800 W 的條件下提取60 min，6000 r/min離心8 min，棄去沉淀收集上清液；將殘?jiān)凑丈鲜龇椒ǚ磸?fù)提取2次，合并所有上清液后在40℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮20 min；采取冷凍干燥的方法獲得辣木葉多酚粉末，樣品放置于-80 ℃保存。

1.2.2 辣木葉多酚濃度的測定

參考趙謀明［21]、林詩洋［23]等方法，采用福林—酚法測定辣木葉中多酚含量，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0、10、30、50、70、100、150、200、300、400、500 mg/mL；吸取1 mL 辣木葉多酚粗提液，加入0.5 mL 福林酚試劑，充分搖勻后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的飽和碳酸鈉溶液1.5 mL；之后補(bǔ)加7 mL 去離子水定容至10 mL，室溫下避光孵育1 h，以4℃12000 g 離心8 min，于760 nm 波長處測量吸光度。獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝2.1438x＋0.1308（R2＝0.9938）。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將HCT116 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的F-12 培養(yǎng)液中，將NCM460細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈酶素混合液的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37℃，含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 細(xì)胞活力測定

取對數(shù)生長期的HCT116 細(xì)胞和NCM460 細(xì)胞，接種于96 孔板中培養(yǎng)，24 h 后棄去培養(yǎng)液，分別加入不同濃度的辣木多酚（50、100、200、400 μg/mL）處理細(xì)胞。此外選用辣木多酚中6 種主要單體成分蘆丁、山奈酚、綠原酸、槲皮素、異槲皮素、金絲桃苷分別處理細(xì)胞，每種藥物濃度均為（5、10、20、40、80 μg/mL），同時(shí)以不添加辣木多酚組別為空白對照組；置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，分別孵育24、48、72 h 后；各孔加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀上490 nm 波長處測定各孔吸光度（A 值），按照以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.5 細(xì)胞克隆形成能力測定

將HCT116 細(xì)胞接種于6 孔板中，用80%乙醇提取的辣木多酚處理細(xì)胞48 h 后，換含有胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；至空白對照組細(xì)胞生長至80%，用預(yù)冷的PBS 洗2 次，4%多聚甲醇固定液固定10 min；棄去甲醇固定液，加入0.1%結(jié)晶紫染色30 min，用PBS 清洗后風(fēng)干并拍照，計(jì)數(shù)克隆并按照下式計(jì)算細(xì)胞克隆形成率。

1.2.6 細(xì)胞劃痕生長能力測定

將HCT116 細(xì)胞接種于6 孔板，待孔中細(xì)胞密度長至80%時(shí)，用200 μL 塑料移液管頭垂直于孔板，自上而下制造劃痕，棄去培養(yǎng)基，加入辣木多酚處理，拍照后繼續(xù)培養(yǎng)48 h；后用PBS 溶液沖洗2 次，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液，拍照記錄，使用Image J Pro軟件計(jì)算各組劃痕部位細(xì)胞遷移面積。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測

將HCT116 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，加入80%乙醇提取的辣木多酚繼續(xù)培養(yǎng)；用不含EDTA 的胰酶消化離心收集細(xì)胞，冰PBS 清洗3 遍，收集細(xì)胞，以1200 r/min 離心3 min；棄去上清液，按照AnnexinV-FITC 凋亡試劑盒說明書進(jìn)行染色，加100 μL 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞后，加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution，輕輕混勻，避光，室溫反應(yīng)15 min；加入400 μL 1×Binding Buffer，以200 目濾布過濾后將樣品置于冰上，采用流式細(xì)胞儀和Flow Jo 9.0軟件檢測并分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.8 細(xì)胞蛋白表達(dá)量檢測

為進(jìn)一步探究辣木多酚對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，采用Western blot 技術(shù)對HCT116 細(xì)胞內(nèi)2 個(gè)主要凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2 進(jìn)行檢測。將細(xì)胞按每皿9×105個(gè)接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，加入辣木多酚，培養(yǎng)48 h 后用PBS 清洗3 遍，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，于4℃下12000 r/min 離心10 min后取上清液；采用BCA法測定細(xì)胞蛋白濃度，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電泳結(jié)束后在冰水浴條件下將分離膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h 后孵育抗體4℃過夜，經(jīng)TBST 清洗3 遍后孵育兔抗1 h，加入ECL 試劑發(fā)光成像，拍照，并用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

測量數(shù)據(jù)用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用Graphpad Prism 5.0 軟件、SPSS 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度乙醇提取的辣木多酚對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

如圖1-A 所示，不同濃度（20%、50%、80%）乙醇提取的辣木多酚對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 增殖均有抑制作用，其中80%乙醇提取的辣木多酚對HCT116 細(xì)胞抑制效果最好，且隨著作用時(shí)間延長，處理濃度增加，抑制作用越明顯。當(dāng)劑量為400 μg/mL 時(shí)，處理細(xì)胞48 h 后抑制率達(dá)到96.4%以上，抑制作用呈劑量依賴性。各濃度組細(xì)胞抑制率與對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)圖1-B顯示，不同濃度（20%、50%、80%）乙醇提取的辣木葉多酚對人結(jié)腸正常細(xì)胞NCM460幾乎無抑制作用，不影響其正常生長。

2.2 辣木多酚單體成分對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

為明確辣木多酚提取物中單體成分對HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用，選擇辣木葉中含量較高的6種酚類單體山奈酚、槲皮素、異槲皮素、綠原酸、蘆丁和金絲桃苷為原料，分別將這6 種單體以5、10、20、40、80 μg/mL 的濃度處理HCT116 細(xì)胞，孵育24、48、72 h后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，測定細(xì)胞存活率，結(jié)果見圖2。所有單體處理細(xì)胞24～48 h 后，低濃度劑量下多種單體對結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞無顯著抑制作用，而高濃度40和80 μg/mL 劑量下對HCT116 細(xì)胞有一定抑制作用，但抑制率不高。80 μg/mL 的山奈酚、槲皮素、異槲皮素、綠原酸、蘆丁、金絲桃苷分別處理HCT116 細(xì)胞72 h，其抑制率 分 別 為28.34%、 48.12%、 45.03%、 43.27%、42.56%和44.85%。與辣木多酚混合物相比，酚類單體對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制效果均沒有辣木多酚混合物好，推測辣木多酚對HCT116 細(xì)胞的抑制作用可能是通過多種單體協(xié)同作用。

2.3 辣木多酚對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 生長遷移能力的影響

經(jīng)結(jié)晶紫染色固定后，辣木多酚處理HCT116細(xì)胞的克隆形成率如圖3-A、3-B 所示。與對照組相比，50、100、200 μg/mL 辣木多酚處理組的克隆形成率顯著降低，且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞克隆形成數(shù)呈降低趨勢。為進(jìn)一步觀察辣木多酚處理后細(xì)胞的遷移能力，采用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察并測量了細(xì)胞的遷移距離。結(jié)果表明，與對照組相比，辣木多酚處理組細(xì)胞的劃痕寬度明顯大于對照組，24 h后對照組細(xì)胞已出現(xiàn)愈合跡象，而辣木多酚處理組劃痕沒有愈合（圖3-C、3-D）。表明80%乙醇提取的辣木多酚阻礙結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的遷移能力具劑量依懶性。

2.4 辣木多酚對HCT116細(xì)胞凋亡的影響

凋亡細(xì)胞的顯著特征是細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，并能夠特異性結(jié)合Annexin V染料，PI 是一種核酸染料，可以透過凋亡細(xì)胞和晚期細(xì)胞的細(xì)胞膜進(jìn)行特異性結(jié)合。本研究采用Annexin V/PI 雙染法檢測80%乙醇提取的辣木多酚處理人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞48 h后的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。結(jié)果如圖4-A 所示。Annexin V 陽性凋亡細(xì)胞隨多酚混合物濃度的增加而增加。如圖4-B所示，與對照組相比，50、100、200 μg/mL 多酚處理后細(xì)胞凋亡率（早期凋亡細(xì)胞＋晚期凋亡細(xì)胞）分別為19.2%、23.57%、30.62%，表明80%乙醇提取的辣木多酚可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。此外，通過Western blot技術(shù)從分子機(jī)制方面探究了凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)情況（圖4-C、4-D、4-E），分別用50、100、200 μg/mL的80%乙醇提取的辣木多酚處理細(xì)胞48 h 后，HCT116 細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)有增加趨勢，而細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)水平降低，表明辣木多酚誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是由內(nèi)在凋亡途徑所驅(qū)動(dòng)的。

3 討論

本研究以辣木葉為原料，評估了辣木多酚及其中主要酚類單體在結(jié)腸癌細(xì)胞中的抗腫瘤作用，采用3 種不同濃度（20%、50%、80%）乙醇溶液提取的辣木多酚作用于人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，80%醇提辣木多酚的抑制作用優(yōu)于20%和50%醇提多酚。當(dāng)劑量達(dá)到400 μg/mL時(shí)，HCT116細(xì)胞的抑制率達(dá)96.4%以上。Lin 等［24]、Yi 等［25]研究藍(lán)莓多酚和蘋果多酚的抗結(jié)腸癌作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蘋果多酚和藍(lán)莓多酚的濃度分別達(dá)到2和10 mg/mL 時(shí)，才能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長［24-25]。因此，與其他植物多酚相比，辣木葉多酚似乎發(fā)揮了更多抗結(jié)腸癌的作用。為了明確辣木葉多酚中單體成分對結(jié)腸癌增殖的抑制效果，本研究選用山奈酚、槲皮素、綠原酸、異槲皮素、蘆丁、金絲桃素6種辣木多酚單體作用于HCT116 細(xì)胞，結(jié)果表明，多酚單體對HCT116 細(xì)胞增殖的抑制作用遠(yuǎn)不如多酚提取物，表明多酚類單體主要通過協(xié)同作用來發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用。也有研究表明，大多數(shù)植物提取物不是單一成分作用，而是多種物質(zhì)的協(xié)同作用和凝集作用［26-27]。

細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞增殖和死亡動(dòng)態(tài)平衡中非常重要的因素，細(xì)胞凋亡功能的喪失或受抑制是腫瘤發(fā)生的一個(gè)非常重要的因素［28]。在腫瘤治療中腫瘤細(xì)胞是否凋亡是判斷腫瘤治療成功與否的關(guān)鍵因素之一。因此，抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移并提高細(xì)胞凋亡的速率是藥物具有抗癌作用的前提［29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，辣木多酚不僅能明顯抑制HCT116 細(xì)胞的克隆形成和細(xì)胞遷移，而且能夠使HCT116 細(xì)胞凋亡率增加；蛋白免疫技術(shù)的結(jié)果也表明，辣木多酚處理HCT116 細(xì)胞后，主要調(diào)控凋亡的2 種蛋白（Bax和Bcl-2）的表達(dá)發(fā)生了變化，其中，促進(jìn)凋亡的Bax 蛋白表達(dá)有增加趨勢，而抗凋亡的Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著降低，這2 種蛋白表達(dá)的改變導(dǎo)致HCT116 細(xì)胞凋亡加速，表明辣木多酚抑制結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖的潛在機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。