桑 花，朱衛(wèi)忠，鄭惠華，湯志遠(yuǎn)**

1 南通大學(xué)，南通大學(xué)附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，南通 226001；2 南通大學(xué) 藥學(xué)院，南通 226001；3 江蘇安惠生物科技有限公司，南通 226000

真菌云芝的提取物云芝多糖及糖肽對乳腺癌[1]、胃癌[2]、結(jié)腸癌[3]、食管癌[4]、肺癌[5]等均有明顯抑制和治療作用。此外，其在肝保護(hù)方面也有顯著效果[6]，現(xiàn)已開發(fā)出如云芝胞內(nèi)糖肽膠囊、云芝菌膠囊、云芝肝泰膠囊等藥物。其抗腫瘤作用機(jī)制主要通過抗炎或調(diào)節(jié)人體免疫功能，提高宿主免疫反應(yīng)，間接抑制腫瘤發(fā)生和生長[7]，臨床上常與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用。而化療藥物在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為受到多種轉(zhuǎn)運(yùn)體及代謝酶的調(diào)控，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)運(yùn)行為的主要有常規(guī)藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體p-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）等。腫瘤細(xì)胞上藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的改變直接影響了絕大部分化療藥物的藥效。有不少報(bào)道，中藥通過影響藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)而達(dá)到增效減毒的效果。日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)，口服化療藥物及云芝糖肽的胃癌患者比單獨(dú)服用化療藥物的患者總體生存期高[2]；其機(jī)制研究主要圍繞免疫增強(qiáng)展開，目前還未有從藥物相互作用角度探究云芝糖肽輔助化療藥物增效的機(jī)制研究。多柔比星是P-gp 的底物，其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的累積量與外排轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp 的表達(dá)密切相關(guān)。因此本研究從藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體入手，探討云芝糖肽增加化療藥物多柔比星抗腫瘤藥效的機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材 料

1.1 細(xì)胞株

人胃癌腫瘤細(xì)胞AGS 細(xì)胞株，購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥品和試劑

云芝胞內(nèi)糖肽膠囊 （江蘇蘇中藥業(yè)，批號：19110804）；鹽酸多柔比星（中國食品藥品檢定研究院，純度98%）；鹽酸鄰甲苯海拉明（IS，上海阿拉丁生化科技公司）；胎牛血清（以色列BI 公司）；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；CCK-8 試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）；FITC 偶聯(lián)p-gp 及同型對照多克隆抗體、TRIzol（美國賽默飛世爾科技）；TB Green Premix Ex TaqTMⅡPCR 試劑、PrimeScriptTMRT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司）；色譜級甲醇（德國默克公司）；色譜級甲酸（美國Dikma 公司）；其他試劑為分析純；水為超純水。

1.3 儀器

Imark 型酶標(biāo)儀 （BIO-RAD）；Nano Drop One微量核酸蛋白濃度測定儀（美國Thermo 公司）；Accuri C6 型流式細(xì)胞分析儀（美國BD 公司）；qTOWER 2.0 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀 （德國Analytik Jena公司）；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀API 3200 LC-MS/MS（美國ABSciex 公司）；超純水儀（德國密理博）。

2 方 法

2.1 云芝糖肽及多柔比星儲備液配制

取6 粒（0.5 g/粒）云芝胞內(nèi)糖肽膠囊的內(nèi)容物，加30 mL 無菌生理鹽水配制成100 mg·mL-1的藥液。鹽酸多柔比星用純DMSO 配制成20 mmol·L-1儲備液，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋到適宜濃度。藥品儲備液冰箱4 ℃保存。

2.2 通過CCK-8 實(shí)驗(yàn)考察云芝糖肽對多柔比星細(xì)胞藥效的影響

取對數(shù)生長期的AGS 細(xì)胞，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞基本貼壁后，每孔加入含藥無血清培養(yǎng)基200 μL。多柔比星組給藥濃度如下：0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μmol·L-1；多柔比星+云芝糖肽組在多柔比星組的基礎(chǔ)上每孔加入云芝糖肽藥液使終濃度為1 mg·mL-1，每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)平行樣本，給藥48 h。作用結(jié)束后，吸出藥液，每孔加入含10 μL CCK-8 試劑的培養(yǎng)基100 μL，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h，將細(xì)胞培養(yǎng)板于酶標(biāo)儀450 nm 波長處檢測其吸光度值（A），通過SPSS 計(jì)算藥物IC50值。

抑制率（%）=1-（A給藥組-A本底）/（A對照組-A本底）×100%

2.3 LC-MS/MS 測定多柔比星在AGS 細(xì)胞內(nèi)的累積

分別取對數(shù)生長期的AGS 細(xì)胞，接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待24 h 細(xì)胞基本貼壁后，吸出含血清培養(yǎng)基，每孔加入含云芝糖肽（0、0.2、0.5、1.0 mg·mL-1）的無血清培養(yǎng)基1 mL，作用48 h，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行樣本；然后每孔加入多柔比星使其終濃度為10 μmol·L-1，作用時(shí)間2 h。作用結(jié)束后，冰PBS 液清洗細(xì)胞2 遍，每孔加入300 μL 超純水，置-80 ℃冰箱反復(fù)凍融3 次，破碎細(xì)胞，取20 μL 細(xì)胞懸液以BCA 法測定蛋白濃度，取100 μL 細(xì)胞懸液，加入300 μL 含內(nèi)標(biāo)（IS，5 μg·L-1鄰甲苯海拉明）的甲醇溶液，振蕩、離心2 次后，取5 μL 上清液進(jìn)樣。胞內(nèi)藥物累積量用每毫克蛋白質(zhì)吸收的藥物量表示。

色譜條件：色譜柱Luna 3u C18（2）柱，150 mm×2.0 mm，100 A （Phenomenex）；流動(dòng)相由0.1%甲酸（A）和甲醇（B）組成，梯度洗脫：0～0.5 min（20%B）、0.5～0.8 min（20%～80%B）、0.8～4 min（80%～20%B）、4～8.5 min（20% B）；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣盤溫度為4 ℃；流速為0.2 mL·min-1。

質(zhì)譜參數(shù)：電噴霧離子源（ESI）；正離子檢測；離子噴霧電壓：4.8 kV；加熱毛細(xì)管溫度：285 ℃；鞘氣（N2）流速：735 kPa；輔助氣（N2）：1050 kPa；碰撞氣（Ar）壓力：1.5 kPa；多反應(yīng)離子檢測（MRM）；用于定量分析的離子對分別為m/z 544.2→361.2 （多柔比星）和m/z 270.2→181.2（鄰甲苯海拉明）。

2.4 RT-PCR 法測定AGS 細(xì)胞P-gp、BCRP、MRP 轉(zhuǎn)運(yùn)體的mRNA 表達(dá)水平

取對數(shù)生長期的AGS 細(xì)胞，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞基本貼壁后，每孔加入含云芝糖肽（0、0.2、0.5、1.0 mg·mL-1）的無血清培養(yǎng)基2.5 mL，作用48 h，每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)平行樣本。①用TRIzol提取細(xì)胞總RNA；②參照PrimeScriptTMRT Master Mix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；③按照TB Green Premix Ex TaqTMⅡ說明書進(jìn)行PCR 檢測得到Ct 值；④采用2-ΔΔCT法（Livak 法）半定量分析RT-PCR 檢測結(jié)果。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測AGS 胃癌細(xì)胞表面P-gp 蛋白的表達(dá)

取對數(shù)生長期的AGS 胃癌細(xì)胞，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞基本貼壁后，每孔加入含云芝糖肽（0、0.2、0.5、1.0 mg·mL-1） 的無血清培養(yǎng)基2.5 mL，作用48 h，每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)平行樣本。作用完成后，胰酶消化液消化細(xì)胞；加入FITC 偶聯(lián)的抗Pgp 多克隆抗體（1%BSA-PBS 配制，稀釋比例為1∶20）或同型對照（未進(jìn)行免疫小鼠血清純化的IgG1）100 μL，37 ℃避光孵育2 h，用流式細(xì)胞儀檢測AGS細(xì)胞表面P-gp 的表達(dá)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 云芝糖肽對多柔比星在AGS 胃癌細(xì)胞內(nèi)藥效的影響

通過線性回歸分析得到云芝糖肽單獨(dú)作用AGS 細(xì)胞72 h 的IC50為3.9 mg·mL-1，選擇1.0 mg·mL-1的云芝糖肽作用于AGS 細(xì)胞48 h 時(shí)，對細(xì)胞沒有毒性。多柔比星單獨(dú)作用AGS 細(xì)胞48 h 的IC50為0.587 μmol·L-1，當(dāng)聯(lián)合1.0 mg·mL-1的云芝糖肽時(shí)，IC50顯著降低為0.173 μmol·L-1，見圖1。云芝糖肽能顯著提高多柔比星對AGS 細(xì)胞生長的抑制率，提高其藥效，與單用多柔比星相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2 云芝糖肽對多柔比星在AGS 胃癌細(xì)胞內(nèi)累積的影響

經(jīng)不同濃度云芝糖肽作用48 h 后，LC-MS/MS結(jié)果顯示在AGS 胃癌細(xì)胞內(nèi)，多柔比星給藥2 h 的累積量較對照組顯著增加，且隨著給藥濃度的提高，細(xì)胞內(nèi)累積量增加，中、高濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），見圖2。表明云芝糖肽提高多柔比星的藥效是可能通過提高多柔比星在細(xì)胞內(nèi)的濃度達(dá)到的。

3.3 云芝糖肽對AGS 胃癌細(xì)胞P-gp、BCRP、MRP 的mRNA 表達(dá)的影響

經(jīng)過不同濃度云芝糖肽作用后，熒光定量RTPCR 結(jié)果顯示，云芝糖肽在中、高濃度能顯著抑制P-gp 的基因表達(dá)（P<0.05），且隨著濃度升高，抑制強(qiáng)度增大，見圖3-A。而云芝糖肽對BCRP、MRP 的mRNA 表達(dá)沒有顯著影響（見圖3-B，3-C）。結(jié)果表明，云芝糖肽能抑制AGS 胃癌細(xì)胞P-gp 轉(zhuǎn)運(yùn)體的mRNA 表達(dá)。

3.4 云芝糖肽對AGS 胃癌細(xì)胞表面P-gp 蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)不同濃度云芝糖肽作用48 h 后，細(xì)胞流式結(jié)果顯示AGS 細(xì)胞表面的P-gp 蛋白表達(dá)（見圖4，彩色）隨給藥濃度的增加而逐漸降低，表明云芝糖肽能抑制AGS 細(xì)胞膜上P-gp 轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，從而影響細(xì)胞內(nèi)依賴P-gp 轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物累積。

4 討論

云芝糖肽作為免疫增強(qiáng)藥，主要用于慢性乙型肝炎和肝癌的輔助治療以及增強(qiáng)免疫力。云芝糖肽的直接細(xì)胞殺傷作用很弱，主要通過影響巨噬細(xì)胞或者抑制腫瘤血管生成而間接發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用，還能激活中性白細(xì)胞，拮抗化療藥所致細(xì)胞免疫抑制，改善細(xì)胞免疫功能。

癌癥治療中的藥物相互作用一直是臨床用藥必須考慮的方面，肝藥酶抑制劑、誘導(dǎo)劑直接影響了其它藥物的代謝，造成藥效降低或者毒性增加。化療藥物作為非靶向制劑，如何提高其在腫瘤中的濃度一直是研究的重點(diǎn)，已有研究證明，中藥及其相關(guān)制劑可以提高藥物在腫瘤中的分布，如參麥注射液可以提高多柔比星、紫杉醇、5-FU 在結(jié)腸癌細(xì)胞及荷瘤鼠腫瘤中的累積，起到增效減毒的作用[8]。其他真菌多糖如靈芝多糖能逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥株的多藥耐藥[9]，而云芝多糖及糖肽還未有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究從藥物相互作用入手，以尋找云芝糖肽通過改變藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)從而影響化療藥物的藥效機(jī)制。實(shí)驗(yàn)顯示，云芝糖肽在體外能顯著增加多柔比星對AGS 胃癌細(xì)胞的藥效，表明其有協(xié)同增效的作用。確定云芝糖肽可以提高多柔比星的藥效后，從藥物代謝角度探究云芝糖肽是否影響多柔比星在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的累積，以LC-MS/MS 測定腫瘤細(xì)胞內(nèi)多柔比星的濃度，結(jié)果顯示，云芝糖肽顯著增加胞內(nèi)多柔比星的累積量。隨后，RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，云芝糖肽能顯著抑制AGS 胃癌細(xì)胞的P-gp mRNA 表達(dá)，且隨著給藥濃度增加抑制強(qiáng)度增加。進(jìn)一步使用流式細(xì)胞術(shù)對腫瘤細(xì)胞表面P-gp 蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測，得到與RT-PCR 一致的結(jié)果。

綜上所述，本研究從體外細(xì)胞角度發(fā)現(xiàn)，云芝糖肽提高多柔比星在AGS 腫瘤細(xì)胞藥效的機(jī)制可能與抑制P-gp 的表達(dá)有關(guān)，細(xì)胞上藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的減少降低了多柔比星的外排，提高了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的多柔比星的濃度，增加細(xì)胞毒性，達(dá)到協(xié)同增效的作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)部分，將采用荷瘤鼠模型研究云芝糖肽的協(xié)同抗腫瘤作用。本研究期望為云芝胞內(nèi)糖肽膠囊在臨床上的輔助化療作用增加新的依據(jù)。

致謝

感謝南通市疾病預(yù)防控制中心對本研究提供液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的支持。