楊愛華，施 卉，許 波，卞姜培，鄭 麗**

1 南通市婦幼保健院 藥事科，南通 226018；2 南通大學(xué)藥學(xué)院，南通 226001

母兒血型不合是指孕婦與胎兒間血型不合產(chǎn)生的同族血型免疫病[1]，該病可導(dǎo)致孕期早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎等[2]，新生兒出生后也可導(dǎo)致黃疸及新生兒溶血性貧血[3]。本課題組前期研究表明茵陳蒿湯（茵陳、梔子、大黃）用于治療該病，可降低母體血清抗體效價(jià)、改善妊娠結(jié)局[4]、新生兒溶血性貧血的臨床癥狀；但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并不明確。

6，7-二甲氧基香豆素（6，7-dimethoxycoumarin，6，7-DOC），又稱濱蒿內(nèi)酯（scoparone），從茵陳中提取。文獻(xiàn)[5，6]表明，6，7-DOC 有抗炎、抗腫瘤、保肝和心血管活性等作用，且是治療母兒ABO 血型不合、預(yù)防新生兒溶血性貧血的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[7]，然而其在紅血球分化中的作用尚未被證實(shí)。在本研究中，使用人慢性髓原白血病細(xì)胞（簡(jiǎn)稱K562 細(xì)胞）來評(píng)價(jià)6，7-DOC 對(duì)K562 細(xì)胞紅系分化的影響。

1 材 料

1.1 細(xì)胞株

K562 細(xì)胞購(gòu)自上海蓋寧生物科技公司。

1.2 藥品、試劑與儀器

藥品與試劑：6，7-DOC（純度>99%，世洲生物，南京）；氯化高鐵血紅素（Hemin，Sigma 公司）；10%胎牛血清（FBS，Hyclone 公司）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（索萊寶科技有限公司），Western 化學(xué)發(fā)光試劑盒（ECL，Perkin Elmer 公司）；蛋白分子量Marker（Fermentas 公司）；GAPDH 兔抗人多克隆抗體（Abcom公司）；α-globin、β-globin、γ-globin 一抗、兔二抗（CST 公司）；二甲亞砜（DMSO）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒CCK-8（碧云天試劑公司）。

儀器：Forma Series ⅡCO2培養(yǎng)箱（Thermo 公司）；低溫離心機(jī)（Beckman Coulter 公司）；流式細(xì)胞儀（Accuri Cytometers 公司）；顯微鏡（Olympus 公司）；Power Wave.X34 型多道掃描酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司）；BIO-RAD 電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad L 公司）。

1.3 試劑的配制

1.74mg 6，7-DOC 溶 解于10 mL 甲醇得到1 mmol·L-1溶液，分別用純水稀釋1000、200、100 倍得到1、5、10 μmol·L-1的6，7-DOC 液。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將K562 細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI1640 （含雙抗，pH=7.2） 培養(yǎng)基內(nèi)，于37 ℃、5%CO2飽和濕度為95%的恒溫箱中孵育，每2～3 d 傳代一次。細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 藥物分組干預(yù)與誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分為5 組：對(duì)照組、陽性藥（Hemin）組、6,7-DOC 低、中、高劑量組。對(duì)照組加入等量的RPMI1640 培養(yǎng)液，陽性對(duì)照組加入等量的終濃度為24 μmol·L-1的Hemin 工作液，6，7-DOC 低、中、高劑量組濃度分別為1、5、10 μmol·L-1。分別在干預(yù)0、24、48、72 h 收集細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)苯芐胺染色處理。

2.3 聯(lián)苯芐胺染色測(cè)定

采用不同處理方法收集K562 細(xì)胞，用冷磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）沖洗2 次。將含30%H2O2的聯(lián)苯芐胺溶液0.2 mL（冰醋酸2 mg·mL-1）加入懸浮液中，室溫孵育10 min。陽性細(xì)胞染成藍(lán)色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

2.4 免疫印跡分析

采用細(xì)胞裂解液加1%蛋白酶抑制劑（PMSF）提取總蛋白。采用BCA（bicinchoninic acid）法測(cè)定蛋白濃度。40 μg 蛋白質(zhì)10%分離膠進(jìn)行凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，然后用5%脫脂牛奶和0.1%吐溫-20 在3 倍緩沖鹽水中封膜。隨后用一抗在4 ℃孵育過夜，用TBST 緩沖液沖洗3次，用二抗孵育2 h。采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）系統(tǒng)試劑盒檢測(cè)條帶。利用Image J 軟件分析灰度值。

2.5 6，7-DOC 對(duì)K562 細(xì)胞增殖的影響

CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖：收集細(xì)胞，110×g 離心5～10 min，棄去上清液，加入新培養(yǎng)基。重復(fù)110×g離心5～10min，棄去上清液，加入含有CCK-8 的培養(yǎng)基，輕輕吹打均勻，分別加入96 孔板中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm 處的吸光度值（A）。存活率（VR，Viability Rate）=（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組），分別計(jì)算6，7-DOC 濃度為1、5、10 μmol·L-1及Hemin 12、24、48、72 h 的細(xì)胞存活率。所有實(shí)驗(yàn)均為一式3 份。

2.6 6，7-DOC 對(duì)K562 細(xì)胞周期的影響

采用不同濃度的6，7-二甲氧基香豆素處理K562 細(xì)胞，PBS 洗滌3 次。細(xì)胞凋亡分析，細(xì)胞染色按照PI 試劑盒說明書操作，細(xì)胞周期檢測(cè)采用流式細(xì)胞儀。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0 軟件統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間統(tǒng)計(jì)用單因素方差分析。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 6，7-DOC 促進(jìn)K562 細(xì)胞向紅系定向分化

K562 細(xì)胞含有少量血紅蛋白，它的增多是K562 細(xì)胞向紅系分化的標(biāo)志，血紅蛋白含量與聯(lián)苯芐胺染色陽性率呈正相關(guān)，可反映K562 細(xì)胞紅系定向分化的程度。經(jīng)Hemin 誘導(dǎo)后的K562 細(xì)胞可向紅系定向分化，在第4 天達(dá)峰后衰減[8]。

本研究采用24 μmol·L-1Hemin 誘導(dǎo)K652 細(xì)胞向紅系分化作為陽性組，1、5、10 μmol·L-1的6，7-DOC 誘導(dǎo)K652 細(xì)胞，聯(lián)苯芐胺染色結(jié)果見圖1，其聯(lián)苯胺染色陽性率結(jié)果見表2。

表2 K562 細(xì)胞紅系分化的聯(lián)苯芐胺染色陽性率（%，n=3）

由圖2 可知，1μmol·L-16，7-DOC 組聯(lián)苯芐胺染色陽性率與對(duì)照組無明顯差異；5、10μmol·L-16，7-DOC組聯(lián)苯芐胺染色陽性率顯著高于對(duì)照組（**P<0.01），且呈劑量、時(shí)間依賴性。故在紅系標(biāo)志蛋白檢測(cè)試驗(yàn)中，選用10μmol·L-16，7-DOC 作為主要研究對(duì)象。

紅系分化典型標(biāo)志蛋白α-珠蛋白（α-globin）、β-珠蛋白（β-globin）、γ-珠蛋白（γ-globin）的表達(dá)量，是衡量細(xì)胞紅系分化能力的指標(biāo)。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示6，7-DOC 組（10 μmol·L-1）中α、β、γ 珠蛋白表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，結(jié)果見圖3。

3.2 6，7-DOC 抑制K562 細(xì)胞增殖，并使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1 期

用CCK-8 檢測(cè)不同劑量6，7-DOC 對(duì)K562 細(xì)胞增殖的影響，見圖4。1 μmol·L-16，7-DOC 組與對(duì)照組無明顯差異；從第12 h 開始，5、10 μmol·L-1的6，7-DOC 組細(xì)胞增殖減慢，以72 h 為終點(diǎn)，兩組細(xì)胞增殖率均顯著低于對(duì)照組。這表明6，7-DOC 劑量越大、作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制K562 細(xì)胞增殖作用就越強(qiáng)，呈劑量、時(shí)間依賴性。

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同劑量6，7-DOC 對(duì)K562細(xì)胞周期的影響，見圖5。與對(duì)照組比較，1 μmol·L-16，7-DOC 組無顯著差異；5、10 μmol·L-1的6，7-DOC 組G0/G1 期的細(xì)胞比例增高，而S 期細(xì)胞比例顯著下降。而隨著劑量增長(zhǎng)，6，7-DOC 能夠阻止細(xì)胞從G0/G1 期進(jìn)入S 期，DNA 合成受到抑制，提示6，7-DOC 可誘導(dǎo)K562 細(xì)胞周期阻滯于G0/G1 期。

4 討論

細(xì)胞周期分為間期和分裂期。間期又分為G0/G1 期（DNA 合成前期）、S 期（DNA 合成期）和G2 期（DNA 合成后期）；分裂期為M 期。細(xì)胞分化主要發(fā)生在間期。本研究結(jié)果顯示，6，7-DOC 可以誘導(dǎo)處于多能髓樣祖細(xì)胞狀態(tài)的K562 細(xì)胞大量阻滯于G0/G1 期，促使細(xì)胞退出細(xì)胞周期，促進(jìn)分化，因此在本實(shí)驗(yàn)中，6，7-DOC 作為重要的誘導(dǎo)分化劑，抑制細(xì)胞增殖，發(fā)揮其促進(jìn)K562 細(xì)胞紅系分化的作用。

處于多能髓樣祖細(xì)胞狀態(tài)的K562 細(xì)胞含有少量血紅蛋白，而血紅蛋白的增多是K562 細(xì)胞向紅系分化的標(biāo)志。不同時(shí)期，血紅蛋白組成為胚胎血紅蛋白（embryonic hemoglobin，HbE）、胎兒血紅蛋白（fetal hemoglobin，HbF） 和成人血紅蛋白（adult hemoglobin，HbA）[9]。血紅蛋白是紅細(xì)胞主要的物質(zhì)，占到其總量的97%，是評(píng)估貧血的重要指標(biāo)。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6，7-DOC 預(yù)處理后可以顯著增加血紅蛋白標(biāo)志物α-globin、β-globin、γglobin 蛋白的表達(dá)，新生兒溶血性貧血引起的胎兒宮內(nèi)貧血，最主要的表現(xiàn)為低血紅蛋白，因此6，7-DOC 通過增加血紅蛋白合成量，可有效緩解該病的貧血癥狀，是治療HDFN 的重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，本研究結(jié)果提示，6，7-DOC 可能成為治療母兒ABO血型不合所致HDFN 的一個(gè)新方向，擴(kuò)大了對(duì)6，7-DOC 藥理活性的認(rèn)識(shí)，值得深入探究。