趙 艷

(延安大學 醫(yī)學院，陜西 延安 716000)

碳量子點(CQDs)是一種新型的熒光材料，具有良好的光學性能、生物相容性和低細胞毒性等優(yōu)點，受到研究者的廣泛關注，成為了醫(yī)學、生物科學、化學、材料科學等領域的研究熱點[1-3]。碳量子點具有碳骨架結構，通常以分散的形式存在，呈球狀，碳納米顆粒平均粒徑5 nm。除了具有與半導體量子點相似的優(yōu)越熒光性能，這種新型碳納米材料具有反應條件簡單、制得容易、綠色環(huán)保和生物相容性好等優(yōu)點，并可通過化學修飾的手段實現(xiàn)功能化，有望在生物和醫(yī)學檢測等領域實現(xiàn)應用。為了綠色合成碳量子點，越來越多的廉價化合物被用作原料，如檸檬酸[4]、抗壞血酸[5]、蛋白質[6]、氨基酸[7]等。雜原子摻雜是一種廣泛用作功能化的方法。常見的雜原子有氮、硫、磷、硅等。研究人員對氮摻雜的碳量子點進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)氮摻雜能夠顯著增強碳量子點的熒光性能，而且能夠有效改善碳量子點的生物相容性。

大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在環(huán)境中廣泛存在，且對環(huán)境變化非常敏感，由于細胞結構和功能組織與絕大多數(shù)的微生物都很類似，是一種廣泛使用的研究細胞生物學和分子的模型生物。此外，大腸桿菌還被廣泛應用于研究重金屬[8]、除草劑[9]及納米材料[10]等外源性物質的毒性。

本文工作采用抗壞血酸和賴氨酸、抗壞血酸和乙二胺2種原料，在水溶液中制備了2種氮摻雜碳量子點，選取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為實驗菌種，用藥敏法進行了抑菌實驗，測定了2種氮摻雜碳量子點的抑菌性能，以更直觀的現(xiàn)象觀察氮摻雜碳量子點的抑菌性能。通過本實驗的研究，改變合成材料而改變碳量子點的抑菌性能，降低它對細胞的毒性，使其具有很好的生物兼容性，拓寬了碳量子點在生物分析中的應用，對碳量子點在生物技術和醫(yī)學細胞技術的應用有一定的參考價值。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

LS-55熒光分光光度計(美國PE)；UV-2550紫外可見分光光度計(上海島津國際貿易有限公司)；MM823LA6-NS美的微波爐(廣東美的微波電器制造有限公司)；YC-330醫(yī)用冷藏箱(青島澳柯瑪超低溫冷凍設備有限公司)；抑菌劑載體(5 mm直徑圓形定性慢速濾紙片，經壓力蒸汽滅菌處理后，置120°烤干2 h，保存?zhèn)溆?；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司)；微量移液器(5 mL-50 mL，可調式)；游標卡尺(成都量具刃具總廠)；一次性塑料平板；接種環(huán)；玻璃試管。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(pH 7.2～7.4)，北京奧博星生物技術有限責任公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(pH 7.2～7.4)，北京奧博星生物技術有限責任公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0.03 mol/L，pH 7.2)；所以試劑均為分析純，實驗用水為超純水(大于18.2 ΩM·cm)試驗菌株為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，均來源于西安交通大學醫(yī)學院普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 碳量子點的合成

分別合成兩種碳量子點(CQDs)：

抗壞血酸和乙二胺為原料合成的CQDsA[11]：稱取0.1862 g抗壞血酸，加入50 mL水溶解于燒杯中，磁力攪拌10 min后，加入5.00 mL乙二胺，置于圓底燒瓶中，于363 K下回流3 h，冷卻至室溫，過濾得到透明的黃色上清液，用水定容至250 mL，其濃度為2.54×10-2mol/L(以碳計)。

抗壞血酸和賴氨酸合成的CQDsB[12]：稱取0.1981 g抗壞血酸和0.1658 g賴氨酸于50 mL燒杯中，加入20 mL超純水充分攪拌溶解后放置微波爐內，550W功率下微波2.0 min，無色透明溶液變成淡黃色透明溶液，表明CQDs逐漸形成。為去除大顆粒物質，以轉速1000 r/min離心10 min，用0.22 μm濾膜純化上清液，透析12 h，取上清液得到CQDs溶液，其濃度為6.75×10-2mol/L(以碳計)。

2 抑菌性實驗

2.1 菌懸液的制備

在潔凈工作臺上，用接種環(huán)挑取一定量的供試菌株接入試管斜面培養(yǎng)基上。然后置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)18～24 h，將供試菌株活化，再用滅菌的生理鹽水配制濃度為107～108cfu·mL-1的菌懸液，備用。

2.2 抑菌樣片的制備

取定性濾紙，用打孔機打成5 mm直徑的圓形小紙片，將濾紙片放入清潔干燥的培養(yǎng)皿中，高壓消毒滅菌后，備用。取無菌干燥的直徑為5 mm的定性濾紙片，每片滴加量子點溶液20 mL，然后將濾紙片平放于清潔無菌的平板中，開蓋置于電熱恒溫培養(yǎng)箱(37℃)中烘干，備用。

2.3 空白對照樣片的制備

取無菌干燥的直徑為5 mm的濾紙片，每片滴加無菌純水20 mL，干燥后備用。

2.4 染菌平板的制備

用接種環(huán)蘸取濃度為107～108cfu·mL-1的試驗菌懸液，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面上均勻涂抹3次，每次涂抹轉動平板60°。蓋好平板，置于室溫干燥5 min。

2.5 量子點的抑菌活性測定

在無菌潔凈工作臺上，用無菌鑷子取抑菌樣片貼放染菌平板表面，每個平板放3片試驗樣片，1片空白對照，共計4片。貼好以后，用無菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面。蓋好平皿，將平板倒置在37℃的生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察紙片周圍有無抑菌圈，并測量抑菌圈的直徑，以抑菌圈直徑d大小進行判斷(d≤7 mm表示無抑菌作用；7 mm

3 結果與討論

3.1 紫外光譜

將CQDsA用水稀釋1000倍后得到2.54×10-5mol/L的CQDs溶液測定其吸收光譜如圖1(曲線1)。CQDsA在波長220～350 nm的紫外區(qū)有較強的吸收，吸收峰位于262 nm處。

1.CQDsA 2.CQDsB

將CQDsB用水稀釋1000倍后得到6.75×10-5mol/L的CQDs溶液測定其吸收光譜如圖1(曲線2)。CQDsB在265 nm處有特征吸收峰，這與芳香族碳氫化合物中π鍵構型、碳碳雙鍵的π-π*躍遷及擴展共軛效應密切相關[14]。2種CQDs的紫外吸收光譜與文獻報道方法[15]吻合，CQDs在可見光區(qū)域都沒有明顯吸收，但在紫外區(qū)域有顯著的吸收。掃描波長越短，吸收強度越大，是CQDs的典型吸收光譜。圖譜光滑無雜峰。由于量子點在可見區(qū)沒有特征吸收峰，故限制了其應用范圍。

3.2 熒光光譜圖

CQDs是一種在水溶液中可以發(fā)出很強熒光的納米材料。CQDsA是以乙二胺作為氮源制備的碳量子點，不同激發(fā)光下的發(fā)射光譜如圖2所示。從圖2可以看出，不同激發(fā)波長對CQDs的熒光位置和強度有較大影響。在激發(fā)波長為360 nm時，對應的最大發(fā)射峰在431 nm處。當激發(fā)波長由360 nm增加到395 nm時，發(fā)射光譜的位置由431 nm紅移到460 nm。隨著激發(fā)波長不斷變化熒光發(fā)射峰也在不斷變化，熒光強度不斷降低，波長發(fā)生紅移。

λex(1-6):320,340,350,360,370,380 nm

CQDsB是以賴氨酸作為氮源制備的碳量子點。其熒光發(fā)射譜圖如圖3所示。從圖3可以看出，在340 nm處，對應的最大發(fā)射峰在422 nm處。在激發(fā)波長340 nm前，CQDs的熒光強度不斷增強且位置發(fā)生紅移，在激發(fā)波長340 nm后，熒光強度不斷下降且發(fā)射波長位置發(fā)生紅移現(xiàn)象。

λex(1-6):320,340,350,360,370,380 nm

從圖2、圖3可以看出，氮摻雜的碳量子點熒光強度大幅度增強，這是由于合成過程中保留了大部分的羧基，為氮摻雜提供大量的活性位點，使得氮摻雜碳量子點的熒光強度大幅增加。碳量子點的熒光發(fā)射波長對激發(fā)波長有一定的依賴性，這種現(xiàn)象可能是由于CQDs表面的缺陷、粒徑尺寸不同、發(fā)射空腔和位置不同，導致了多能級的產生，從而使CQDs的發(fā)射光譜對激發(fā)光具有依賴性[16]。這種現(xiàn)象在CQDs領域普遍存在。

3.3 量子點的抑菌活性測定結果

2種碳量子點的抑菌性能如表1所示?？梢钥闯鯟QDsA對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有明顯的抑菌作用，CQDsA的濃度為2.54×10-2mol/L時，對金黃色葡萄球菌高度敏感，對大腸桿菌中度敏感；CQDsB的濃度為6.75×10-2mol/L時，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均無抑菌作用。

表1 量子點的抑菌圈大小

注：“-”代表無抑菌圈，“+”代表有抑菌圈

圖4A、B分別為CQDsA對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果圖，圖4C、D分別為CQDsB對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果圖。從圖4可以看出CQDsA對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有明顯的抑菌作用，且對金黃色葡萄球菌的抑菌效果強于大腸桿菌。結合抑菌圈大小，說明CQDsA對金黃色葡萄球菌高度敏感，對大腸桿菌中度敏感。CQDsB對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均無抑菌作用，圖中可看出CQDsB對這2種細菌無抑菌圈產生，也從側面說明CQDsB對細胞無毒性，或者說生物毒性很低。

1，2，3為抑菌樣片，4為空白對照樣片。

通過以上實驗可以看出，CQDsA對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有抑菌作用，這是因為CQDsA是氮摻雜的碳量子點(N-CQDs)，N-CQDs表面有氨基的存在，氨基與細菌細胞壁結合，破壞細胞壁的完整性，阻止代謝產物以及營養(yǎng)物質正常穿過細胞膜，使細菌失去營養(yǎng)導致生長停滯，最終細胞凋亡[17]。CQDsB是以賴氨酸為原料經微波合成，賴氨酸是一種人體必需氨基酸，是控制人體生長的重要物質抑長素中最重要的成份，對人的中樞神經和周圍神經系統(tǒng)都有著重要作用。合成的CQDsB生物毒性低，有很好的生物相容性，故對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌無抑菌作用。

3.4 不同濃度碳量子點對供試菌的抑菌效果

因為CQDsB對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均無抑菌作用，圖4實驗中CQDs的濃度已高達1000 mg/L，說明CQDsB無細胞毒性，故不再進行研究。以下主要探討CQDsA對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果。探討了濃度分別為6 mg/L、12 mg/L、24 mg/L、48 mg/L、240 mg/L、480 mg/L的CQDsA溶液對供試菌的抑菌效果，結果見表2。從表中可以看出當CQDsA濃度達到480 mg/L時，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有明顯的抑菌作用，當CQDsA濃度為48 mg/L時，量子點對大腸桿菌無抑菌作用，當CQDsA濃度為24 mg/L時，量子點對兩種細菌均無抑菌作用，說明CQDsA對金黃色葡萄球菌的抑菌作用強于大腸桿菌，這可能與細菌細胞壁的結構有關。金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽性菌，細胞壁含大量的肽聚糖和磷壁酸，磷壁酸所帶的負電荷能與碳量子點上游離的氨基結合，從而干擾細胞膜上部分高活性合成酶的合成，影響細胞正常代謝活動，抑制細菌生長，達到抑菌作用。大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，細胞壁最外層是一層較厚的類脂多糖物質，它能吸附質子化的碳量子點形成聚合物，破壞類脂多糖的結構，擾亂細菌新陳代謝，導致細菌死亡。由于合成過程中質子化的碳量子點較少，對細胞壁破壞能力弱，故抑菌作用較弱。

表2 不同濃度碳量子點溶液的抑菌試驗結果(n=3)

4 結論

本文采用2種方法合成了具有高熒光強度的CQDs，通過對2種革蘭氏細菌的抑菌試驗，初步鑒定了CQDs的抑菌性能。CQDsA用乙二胺作鈍化劑進行表面改性，N原子和C原子半徑相近，作為電子供體對CQDs進行修飾，得到的氮修飾的CQDs表現(xiàn)出更優(yōu)異的光學性能。這些氮原子改變了CQDs的電子分布，故改變了CQDs的性質。此CQDs對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有很強的抑制作用，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果強于大腸桿菌。CQDsB對2種細菌都無抑菌作用。選擇不同合成材料，可以有效的降低碳量子點的生物毒性，使其更好地應用于細胞成像、生物醫(yī)學開發(fā)和利用。