沈春玉 趙玉巧

摘要?為研究天然防腐劑對(duì)調(diào)理石斑魚(yú)腐敗菌的抑菌效果，對(duì)調(diào)理石斑魚(yú)的腐敗菌進(jìn)行分離純化，選擇能適應(yīng)低溫環(huán)境或能產(chǎn)生芽孢的腐敗菌作為試驗(yàn)菌。使用濾紙片法測(cè)定乳酸鏈球菌素、茶多酚、聚賴(lài)氨酸對(duì)試驗(yàn)菌的抑菌效果，同時(shí)采用平板培養(yǎng)法測(cè)定天然防腐劑對(duì)試驗(yàn)菌的最低抑菌濃度（MIC）。試驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸鏈球菌素對(duì)7種試驗(yàn)菌都有抑菌效果，茶多酚對(duì)5種試驗(yàn)菌有抑菌效果，聚賴(lài)氨酸對(duì)3種試驗(yàn)菌有抑菌效果。乳酸鏈球菌素對(duì)試驗(yàn)菌中革蘭氏陽(yáng)性菌抑菌效果最好，其中對(duì)S-3、S-9、S-11和S-13的MIC分別為0.1、0.4、0.5、0.4 mg/mL;茶多酚對(duì)S-3、S-5、S-8、S-10和S-11的MIC分別為0.5、8.0、2.0、0.5、1.0 mg/mL。聚賴(lài)氨酸對(duì)試驗(yàn)菌S-5、S-8和S-10的MIC分別為2.5、1.5、2.0 mg/mL。

關(guān)鍵詞?調(diào)理石斑魚(yú);腐敗菌;抑菌;最低抑菌濃度

中圖分類(lèi)號(hào)?S?986文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）23-0186-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.054

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Studyon the Isolation and Bacteriostasis of Spoilage Bacteria Bacteria from the Prepared Grouper Products

SHEN Chun?yu，ZHAO Yu?qiao?（College of Marine Life and Fisheries，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang，Jiangsu 222005）

Abstract?In order to study the natural preservatives effect on the spoilage bacteria from the prepared grouper products，the spoilage bacteria of the prepared grouper products were isolated and purified，and the spoilage bacteria that can adapt to low temperature environments or produce spores were selected as experimental bacteria.Using filter paper method to determine the antibacterial effect of nisin，tea polyphenols and polylysine on spoilage bacteria.At the same time，the minimum inhibitory concentration （MIC） of natural preservatives against spoilage bacteria was determined by plate culture method.The experimental results showed that nisin had antibacterial effect on 7 experimental bacteria.Tea polyphenol had antibacterial effect on 5 experimental bacteria，and polylysine had antibacterial effect on 3 experimental bacteria.Nisin had the best antibacterial activity against gram?positive bacteria in the experimental bacteria，and the MIC for S-3，S-9，S-11 and S-13 were 0.1，0.4，0.5，0.4 mg/mL.The MIC of tea polyphenols on S-3，S-5，S-8，S-10 and S-11 were 0.5，8.0，2.0，0.5 and 1.0 mg/mL.The MIC of polylysine against experimental bacteria S-5，S-8 and S-10 were 2.5，1.5 and 2.0 mg/mL.

Key words?Prepared grouper products;Spoilage bacteria;Bacteriostasis;MIC

調(diào)理石斑魚(yú)產(chǎn)品以石斑魚(yú)為原料，經(jīng)過(guò)一定加工步驟后，以包裝的形式在冷藏（4 ℃）的條件下儲(chǔ)存和販賣(mài)，可直接食用或食用前只需要簡(jiǎn)單加工或熱處理。該產(chǎn)品采用低熱強(qiáng)度滅菌技術(shù)以保證產(chǎn)品良好的風(fēng)味，但是該技術(shù)使產(chǎn)品滅菌不徹底，在儲(chǔ)存和販賣(mài)的過(guò)程中，產(chǎn)品中殘留的細(xì)菌就會(huì)在適合的條件下生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致產(chǎn)品出現(xiàn)腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，限制產(chǎn)品發(fā)展。目前，該產(chǎn)品腐敗微生物的控制技術(shù)成為產(chǎn)品發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題，而產(chǎn)品腐敗菌的分離及抑菌研究是這個(gè)問(wèn)題得以解決的基礎(chǔ)[1]。

在控制產(chǎn)品腐敗微生物方面，陳佳麗等[2]研究了香辛料對(duì)燒雞中分離的腐敗菌的抑制作用;駱琦[3]從燒雞老湯中篩選了一株耐熱芽孢菌，研究了一系列抑菌方法;馬含笑等[4]研究了Nisin、聚賴(lài)氨酸、單辛酸甘油酯和殼聚糖對(duì)腐敗醬豬肝中分離出的3株污染微生物的抑制作用;白艷紅[5]從低溫熏煮香腸中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的角度出發(fā)，研制成功了2種復(fù)配生物型抑菌劑，延長(zhǎng)了低溫熏煮香腸貨架期。

以上有關(guān)產(chǎn)品腐敗微生物的分離及抑菌研究方面較少，有關(guān)調(diào)理石斑魚(yú)產(chǎn)品腐敗菌的分離及抑菌鮮見(jiàn)。筆者從調(diào)理石斑魚(yú)產(chǎn)品中分離出腐敗微生物，靶向選擇芽孢菌或能夠在低溫儲(chǔ)藏條件下生長(zhǎng)良好的2類(lèi)影響產(chǎn)品品質(zhì)關(guān)鍵菌種作為試驗(yàn)菌，體外研究天然防腐劑[6-8]對(duì)試驗(yàn)菌的抑菌作用，選出高效天然防腐劑，旨在為調(diào)理石斑魚(yú)產(chǎn)品提供防腐理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

石斑魚(yú)（連云港三開(kāi)食品有限公司）;乳酸鏈球菌素（浙江銀象生物工程有限公司）;茶多酚（萬(wàn)利達(dá)生物科技有限公司）;聚賴(lài)氨酸（河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司）。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[9]和芽孢培養(yǎng)基[10]。

1.2?方法

1.2.1?石斑魚(yú)預(yù)處理。將新鮮程度不同的原料石斑魚(yú)分成2組，新鮮度如表1所示，第1組去鱗、去腮、去內(nèi)臟（“三去”）后立即取魚(yú)肉部分培養(yǎng);第2組“三去”后油炸、包裝，30 ℃加速培養(yǎng)3 d。

1.2.2?調(diào)理石斑魚(yú)腐敗微生物的分離和初步鑒定。

使用平板計(jì)數(shù)法分離調(diào)理石斑魚(yú)腐敗微生物，根據(jù)肉眼觀(guān)察菌落形態(tài)、菌落顏色、隆起狀態(tài)、邊緣和表面狀態(tài)，挑選出存在差異的菌落[11]，將其編號(hào)并且記錄形態(tài)、顏色、狀態(tài)等。對(duì)挑選出的菌落進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色[9]的初步鑒定。

1.2.3?不同溫度下腐敗微生物的生長(zhǎng)。

將腐敗微生物接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，分別置于5、10、15、20 ℃溫度下培養(yǎng)，觀(guān)察10 d內(nèi)菌株生長(zhǎng)情況。

1.2.4?菌懸液的制備。

從菌種保藏斜面上取適量菌，研磨洗入15 mL無(wú)菌生理鹽水中，振蕩均勻，菌懸液濃度為107 CFU/mL。

1.2.5?濾紙片法抑菌試驗(yàn)。配制5 mg/mL的乳酸鏈球菌素、茶多酚、聚賴(lài)氨酸溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。同時(shí)配制相同濃度的3種溶液，于121 ℃滅菌20 min后使用。

將滅菌后的Φ6 mm濾紙片置于防腐液中浸泡5 min，貼于涂有0.1 mL菌懸液的細(xì)菌平板上，同種菌株做2組平行樣。將平板置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后取出，測(cè)量抑菌圈大小。

1.2.6?乳酸鏈球菌素MIC的測(cè)定。

配制含乳酸鏈球菌素濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/mL的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，滅菌后倒30 mL該培養(yǎng)基于含有菌懸液的平板中混合均勻，每個(gè)菌株做2個(gè)平行，將平板放入30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，觀(guān)察菌株生長(zhǎng)情況，將沒(méi)有菌生長(zhǎng)的該乳酸鏈球菌素濃度牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為MIC。

1.2.7?茶多酚MIC的測(cè)定。

配制含茶多酚濃度為0、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/mL的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，試驗(yàn)方法同“1.2.6”。

1.2.8?聚賴(lài)氨酸MIC的測(cè)定。

配制含聚賴(lài)氨酸濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg/mL的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，試驗(yàn)方法同“1.2.6”。

2?結(jié)果與分析

2.1?調(diào)理石斑魚(yú)腐敗微生物菌落形態(tài)

從圖1所示的菌相中挑選出13種腐敗微生物，菌落形態(tài)結(jié)果如表2所示，S-1～S-12為第1組預(yù)處理石斑魚(yú)中挑選出的菌落，S-13為第2組加速培養(yǎng)油炸石斑魚(yú)中挑出的菌落。

將這13種菌落劃線(xiàn)分離純化，得到單菌落形態(tài)與初始記錄相符合，對(duì)其進(jìn)行初步的革蘭氏染色、芽孢染色及鏡檢[12]。圖2分別是編號(hào)為S-5號(hào)和S-10號(hào)的菌種劃線(xiàn)分離單菌落形態(tài)圖。

2.2?腐敗微生物菌種的鏡檢結(jié)果統(tǒng)計(jì)

13種腐敗微生物鏡檢結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表3所示，其中球菌較多，S-13能夠產(chǎn)生芽孢。有資料顯示[13-14]，大部分芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢抵抗性較強(qiáng)，耐高溫，能夠在較高溫度下存活，是導(dǎo)致滅菌食品腐敗變質(zhì)的主要原因，且有些芽孢桿菌會(huì)在食品中產(chǎn)生毒素，從而造成腹瀉、嘔吐等不良癥狀。選擇S-13為抑菌試驗(yàn)菌株。

2.3?不同溫度下腐敗微生物生長(zhǎng)結(jié)果

由表4可知， S-3、S-5、S-8、S-9、S-10和S-11能夠在5 ℃良好生長(zhǎng)。由于調(diào)理石斑魚(yú)產(chǎn)品的儲(chǔ)藏和運(yùn)輸條件為4 ℃左右，因此能夠在5 ℃左右生長(zhǎng)良好的菌種會(huì)在儲(chǔ)藏和運(yùn)輸過(guò)程中導(dǎo)致調(diào)理石斑魚(yú)產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)[15]。故將該6種能夠低溫生長(zhǎng)的菌種選為部分試驗(yàn)菌。

2.4?天然防腐劑的抑菌效果

由表5可知，乳酸鏈球菌素對(duì)S-3、S-9、S-11和S-13抑菌圈大，對(duì)S-5、S-8、S-10抑菌圈較小，結(jié)合表2結(jié)果說(shuō)明乳酸鏈球菌素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌抑菌效果極好，對(duì)革蘭氏陰性菌抑菌效果不明顯，這與他人研究的乳酸鏈球菌素對(duì)革蘭氏陰性菌幾乎無(wú)抑菌效果的結(jié)果相符合[16]。茶多酚對(duì)S-3、S-10和S-11也有較大的抑菌圈，對(duì)S-5和S-8的抑菌圈小;聚賴(lài)氨酸僅對(duì)S-8有較大的抑菌圈，對(duì)S-5和S-10的抑菌圈小。比較三者，乳酸鏈球菌素對(duì)試驗(yàn)菌抑菌譜更廣，屬于高效天然防腐劑，茶多酚其次。

2.5?高壓滅菌處理對(duì)天然防腐劑抑菌活性的影響

將表6與表5對(duì)比可知，表6中乳酸鏈球菌素的抑菌圈比表5小很多，高溫處理乳酸鏈球菌素不穩(wěn)定，降低了其對(duì)試驗(yàn)菌的抑菌效果;茶多酚的抑菌圈大小稍有變化，說(shuō)明其熱穩(wěn)定性一般;聚賴(lài)氨酸的抑菌圈大小幾乎無(wú)變化，說(shuō)明聚賴(lài)氨酸具有熱穩(wěn)定性[17]。

2.6?乳酸鏈球菌素MIC的測(cè)定

從表7可以看出，乳酸鏈球菌素對(duì)S-3的MIC為0.1 mg/mL，對(duì)S-9的MIC為0.4 mg/mL，對(duì)S-11的MIC為0.5 mg/mL。繼續(xù)增加乳酸鏈球菌素濃度會(huì)超過(guò)食品添加劑最大允許添加量，而且乳酸鏈球菌素對(duì)革蘭氏陰性菌抑菌效果不好，故未對(duì)S-5、S-8、S-10進(jìn)一步測(cè)定MIC。乳酸鏈球菌素對(duì)該研究試驗(yàn)菌的MIC均高于呂志飛等[18]研究的乳酸鏈球菌素對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC，是因?yàn)榫N及研究方法不同，該研究以平板中是否生長(zhǎng)菌為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定MIC比液體培養(yǎng)測(cè)OD值法更為可靠。

2.7?茶多酚MIC的測(cè)定

從表8可以看出，茶多酚對(duì)S-3和S-10的MIC為0.5 mg/mL，對(duì)S-5的MIC為8.0 mg/mL，對(duì)S-8的MIC為2.0 mg/mL，對(duì)S-11的MIC為1.0 mg/mL。與李柯欣[19]研究結(jié)果的茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的MIC分別為0.25、8.00、10.00 mg/mL相差不大。由于茶多酚對(duì)試驗(yàn)菌的MIC均超過(guò)食品添加劑最大允許添加量，在后續(xù)研究中可配合其他高效防腐劑應(yīng)用于產(chǎn)品，降低其使用量。

2.8?聚賴(lài)氨酸MIC的測(cè)定

從表9可以看出，聚賴(lài)氨酸對(duì)S-5的MIC為2.5 mg/mL，對(duì)S-8的MIC為1.5 mg/mL，對(duì)S-10的MIC為2.0 mg/mL。有研究報(bào)道稱(chēng)[20]，聚賴(lài)氨酸作為一種天然防腐劑，抑菌譜廣，對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、酵母菌以及霉菌等都有較好的抑制作用。其抑菌譜雖廣，但也不能全部抑制，其能抑制的調(diào)理石斑魚(yú)產(chǎn)品中試驗(yàn)菌較少，故后續(xù)不考慮其在調(diào)理石斑魚(yú)產(chǎn)品中的應(yīng)用。

3?結(jié)論

由于石斑魚(yú)生長(zhǎng)環(huán)境溫度低，其攜帶的微生物也適宜低溫生長(zhǎng)，且石斑魚(yú)營(yíng)養(yǎng)豐富，魚(yú)體捕撈死亡后，其攜帶微生物迅速繁殖，因而從調(diào)理石斑魚(yú)中挑選出的13種腐敗微生物中，能夠低溫生長(zhǎng)的菌株占比較多。挑選出的7種試驗(yàn)菌產(chǎn)芽孢或能夠在5 ℃生長(zhǎng)的特性，使得這7種腐敗菌在調(diào)理石斑魚(yú)產(chǎn)品生產(chǎn)和儲(chǔ)存過(guò)程中占有優(yōu)勢(shì)，極易引起產(chǎn)品腐敗，影響產(chǎn)品發(fā)展。

天然防腐劑體外抑菌試驗(yàn)表明，乳酸鏈球菌素對(duì)試驗(yàn)菌具有廣譜抑菌性，乳酸鏈球菌素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌試驗(yàn)菌S-3、S-9、S-11和S-13的MIC分別為0.1、0.4、0.5、0.4 mg/mL，都在食品添加劑最大添加范圍內(nèi);茶多酚對(duì)抑菌效果緊隨其后，對(duì)試驗(yàn)菌S-3、S-5、S-8、S-10和S-11的MIC分別為0.5、8.0、2.0、0.5、1.0 mg/mL;聚賴(lài)氨酸抑菌效果最差，對(duì)試驗(yàn)菌S-5、S-8和S-10的MIC分別為2.5、1.5、2.0 mg/mL。選擇乳酸鏈球菌素和茶多酚這2種高效天然防腐劑做后續(xù)研究。

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