傅規(guī)玉

（邵陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系 422004）

新城疫是由新城疫病毒引起禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病。以高熱、呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、黏膜和漿膜出血為特征。具有很高的發(fā)病率和病死率，是危害養(yǎng)禽業(yè)的一種主要傳染病[1]。OIE 將其列為A 類疫病。我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。新城疫的有效控制關(guān)鍵在于免疫接種和早期檢測(cè)，準(zhǔn)確檢測(cè)是防控雞新城疫的重要環(huán)節(jié)。而雞新城疫抗體水平檢測(cè)方法就是血凝和血凝抑制（HA 與HI）試驗(yàn)[2]。在血凝和血凝抑制（HA 與HI）試驗(yàn)中，用的指示劑就是1%紅細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)主要研究1%紅細(xì)胞濃度對(duì)雞血清中新城疫抗體水平測(cè)定結(jié)果的影響。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

主要器材或設(shè)備，見(jiàn)表1。

1.1.2 主要試劑

主要試劑參見(jiàn)表2。

1.1.3 待測(cè)樣品

1 號(hào)2 號(hào)樣品為雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清；

3 號(hào)4 號(hào)5 號(hào)6 號(hào)樣品為雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清做2 倍稀釋；

7 號(hào)8 號(hào)9 號(hào)10 號(hào)樣品為雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清做4 倍稀釋。

1.2 方法

1.2.1 紅細(xì)胞的配置分為3 組

第一組：取1.5ml 的3.8%檸檬酸鈉到一次性注射器中，健康公雞靜脈采血6ml，將抗凝血分裝到3 個(gè)離心管中，2500r/min 離心5min，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再重復(fù)以上過(guò)程兩次，用生理鹽水分別配成1%紅細(xì)胞懸液A，1.2%紅細(xì)胞懸液B，0.8%紅細(xì)胞懸液C。

第二組：取1.5ml 的3.8%檸檬酸鈉到一次性注射器中，健康公雞翅下靜脈采血6ml，將抗凝血分裝到3 個(gè)離心管中，用生理鹽水洗滌3 次。(1) 第一管每次以2500r/min 離心5min，洗滌3 次后用生理鹽水配成1%紅細(xì)胞懸液A1。(2) 第二管每次以2500r/min 第一次離心5min，第二次離心5min，第三次離心8min，洗滌3 次后用生理鹽水配成1%紅細(xì)胞懸液A2。(3)第三管以2500r/min 三次都離心8min，洗滌3 次后用生理鹽水配成1%紅細(xì)胞懸液A3。

表1 主要器材或設(shè)備表

表2 主要試劑表

第三組：選2 只不同的公雞，公雞J1 是第一次被采雞血，公雞J2 是被多次采過(guò)雞血。分別取0.5ml 的3.8%檸檬酸鈉到一次性注射器中，(1) 在公雞J1 翅下靜脈采血2ml，將抗凝血裝到1 個(gè)離心管中。將離心管中的血液經(jīng)2500r/min 離心5min再配成1%紅細(xì)胞懸液A3。（2）在公雞J2 翅下靜脈采血2ml，將抗凝血分裝到1 個(gè)離心管中。將離心管中的血液經(jīng)2500r/min離心5min 再配成1%紅細(xì)胞懸液A4。

1.2.2 試驗(yàn)方法和判定標(biāo)準(zhǔn)

按照GB/T16550—2008 采用血凝和血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)的操作方法進(jìn)行規(guī)范操作，個(gè)體HI 價(jià)＞1：16 (即41og2) 為免疫合格，群體免疫效價(jià)≥70 為合格。

2 試驗(yàn)結(jié)果

參見(jiàn)表 3～5。

表3 第一組試驗(yàn)結(jié)果

表4 第二組試驗(yàn)結(jié)果

表5 第三組試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

理論上四單位抗原配制的濃度跟著紅細(xì)胞走的。紅細(xì)胞配得濃，四單位抗原相應(yīng)會(huì)濃，紅細(xì)胞配得稀，四單位抗原相應(yīng)會(huì)稀。而在此種情況下做出來(lái)的HI 試驗(yàn)結(jié)果，同樣的血清樣品前者的滴度要低一點(diǎn)，后者高一些。但濃度相差多少會(huì)顯示在結(jié)果上，這就是試驗(yàn)的意義。

（1）血凝和血凝抑制試驗(yàn)中樣品血清沒(méi)有變化，血凝抗原及陽(yáng)性血清都相同，在組1 中，雞紅細(xì)胞濃度不同。在以1%、1.2%、0.8%雞紅細(xì)胞作為指示劑的HA 試驗(yàn)檢測(cè)下，四單位抗原配制濃度是不一樣的。A 是128 倍稀釋，B 是64 倍稀釋，C是256 倍稀釋，在這種情況下檢測(cè)出來(lái)的樣品也會(huì)隨著變化，顯然，同樣的配置方法下，1%紅細(xì)胞濃度相差0.2%，造成血凝和血凝抑制結(jié)果出現(xiàn)差距。

（2）相同的轉(zhuǎn)速、不同的離心時(shí)間洗滌紅細(xì)胞，制備的紅細(xì)胞懸液中所含的紅細(xì)胞數(shù)目不同，3 次離心時(shí)間越長(zhǎng)，血細(xì)胞壓的越緊實(shí)，1%的紅細(xì)胞實(shí)際濃度越高。應(yīng)該是A3＞A2＞A1，但三者的濃度相差不大，在血凝結(jié)果和血凝抑制結(jié)果無(wú)差異。

（3）采不同公雞血制備的1%紅細(xì)胞A4、A5 在血凝和血凝抑制結(jié)果上出現(xiàn)+的差異，說(shuō)明A4、A5 的紅細(xì)胞實(shí)際濃度有差異，A5 的雞血來(lái)源公雞J2，J2 是被多次采過(guò)血，已經(jīng)貧血，導(dǎo)致A5 的實(shí)際濃度偏低，偏低到引起血凝和血凝抑制結(jié)果出現(xiàn)+1 的差距。

4 總結(jié)

（1）明確1%紅細(xì)胞濃度在較大范圍內(nèi)變動(dòng)，如實(shí)際濃度偏高或降低0.2%會(huì)導(dǎo)致血凝和血凝抑制結(jié)果出現(xiàn)差距。

（2）試驗(yàn)要嚴(yán)格按照GB/T16550-1996 操作，在洗滌雞紅細(xì)胞時(shí)要選擇適宜的轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間，2500r/min 的速度離心在新城疫抗體水平測(cè)定競(jìng)賽中第 1、2 次 3min，第 3 次 5min 為宜，可節(jié)約時(shí)間。

（3）在技能競(jìng)賽培訓(xùn)中，同一只雞不要連續(xù)采血超過(guò)兩次，以免影響試驗(yàn)結(jié)果。

（4）加入1%紅細(xì)胞懸液時(shí)應(yīng)先將其充分搖勻，以免每孔中加入的紅細(xì)胞懸液濃度不同造成差異。