潘紅梅，張 亮，孫文陽，張鳳鳴，白小青，郭宗義*，陳 東

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點實驗室，重慶市養(yǎng)豬工程中心，重慶 402460；2.四川省蒼溪縣河地鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，四川蒼溪 628427）

斷奶前仔豬的高死亡率（10%～25%）是造成養(yǎng)豬生產(chǎn)重大經(jīng)濟損失的主要原因之一，也是一直困擾養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的難題之一。影響斷奶前仔豬死亡的一個關(guān)鍵因素是母豬初乳免疫球蛋白G（IgG）含量不足，導(dǎo)致新生仔豬攝入IgG 量不夠，引起仔豬免疫力低下而易感疾病乃至死亡[1]。初乳中IgG 主要來源于母體血液轉(zhuǎn)運或者乳腺組織自行合成[2]。體內(nèi)IgG 是B 細(xì)胞特異表達(dá)的免疫球蛋白[3-4]，從B 細(xì)胞發(fā)育分化到表達(dá)分泌IgG 是一個多級而復(fù)雜的過程，受許多信號分子（如特定的受體和各種轉(zhuǎn)錄因子）的調(diào)控。其中，PI3K-AKTFOXO1 是最為重要且已經(jīng)被證明了的信號通路[5]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)太湖豬在妊娠不同階段血清IgG 含量不同[6]，說明在妊娠期B 細(xì)胞發(fā)育分化以及表達(dá)分泌IgG 不同。在不同妊娠階段PI3K-AKT-FOXO1 信號通路中的各關(guān)鍵基因表達(dá)的變化情況目前尚無研究報道。因此，本研究擬通過測定不同妊娠期榮昌豬血清IgG含量以及乳腺、肝臟和脾臟中PI3K-AKT-FOXO1 信號通路幾個關(guān)鍵基因的表達(dá)情況，試圖闡明PI3K-AKTFOXO1 信號通路對IgG 的調(diào)控作用，以期為初乳IgG的營養(yǎng)調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養(yǎng)管理 試驗?zāi)肛i選自重慶市畜牧科學(xué)院育種豬場。挑選體況、胎次和配種日期一致的榮昌豬經(jīng)產(chǎn)母豬12 頭，按照豬場常規(guī)飼養(yǎng)管理，單圈飼養(yǎng)，自由采食飲水。日糧代謝能12.35 MJ/kg，粗蛋白質(zhì)12.5%。飼養(yǎng)試驗于2017 年5—8 月完成。

1.2 樣品采集 分別于妊娠第5、35、110 天空腹耳靜脈采血，血樣室溫靜置，2 000 r/min 離心，取血清-4℃保存?zhèn)溆?。每次采血后屠? 頭母豬，取乳腺、淋巴和脾臟組織，液氮速凍后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清生化指標(biāo)測定 血清IgG、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）均采用雙抗體夾心法（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）進(jìn)行測定。

1.4 PI3K-AKT-FOXO1 信號通路各基因mRNA 表達(dá)量的測定

1.4.1 RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄 采用RNAiso Plus 試劑提取乳腺、淋巴和脾臟總RNA，參照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒說明書進(jìn)行cDNA 合成。20 μL反轉(zhuǎn)錄體系：PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，5× PrimeScript Buffer（for Real Time）4.0 μL，RNA1.0 μL，RNase Free ddH2O 13 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：37℃ 15 min，85℃ 5 s。

1.4.2 Real-time PCR 定量分析 選擇TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）進(jìn)行Real Time PCR 定量測定。25 μL 反應(yīng)體系：2×TB Green Premix Ex Taq II 12.5 μL，上、下游引物（10 mol/μL）各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，59℃退火30 s，40 個循環(huán)。熒光定量PCR 結(jié)果采用2-ΔΔCt法計算目標(biāo)基因的相對表達(dá)量，看家基因為GAPDH。各基因的引物通過Primer Premier6.0 軟件設(shè)計（表1），由上海生工生物有限公司合成。

表1 基因的引物序列

1.5 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)通過Excel 整理，采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件ANOVA 程序進(jìn)行單因素方差分析。P＜0.05作為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 榮昌豬母豬部分血液生化指標(biāo)的變化 由表2 可以看出，榮昌豬母豬在妊娠第35、110 天血清IgG 含量顯著低于妊娠第5 天，而ALT 則顯著高于妊娠第5 天，其他指標(biāo)差異不顯著。

表2 榮昌豬母豬血液生化指標(biāo)在不同妊娠階段的變化

2.2 不同妊娠階段各基因的表達(dá)量 從表3 可知，乳腺組織各基因在不同妊娠階段的mRNA 表達(dá)沒有差異。妊娠第5 天，AKT在淋巴組織的mRNA 表達(dá)量顯著高于妊娠第35、110 天；而FOXO1在脾臟組織的mRNA表達(dá)量在妊娠第5 天顯著高于第35、110 天。而在妊娠第5 天，PI3K在脾臟中的mRNA 表達(dá)量顯著高于乳腺和淋巴組織。

表3 榮昌豬母豬組織中PI3K-AKT-FOXO1 信號通路各基因的表達(dá)

3 討 論

Bourne 等[7]研究表明，常乳中約90% 的IgA 和IgM 以及70% 的IgG 是由乳腺組織合成，母豬血清中的IgG 含量可能會影響初乳中IgG 含量，因為初乳中幾乎所有的IgG 都來自于母豬血清。對于妊娠母豬來說，IgG 是否會隨著妊娠期的推進(jìn)而發(fā)生變化，最終影響初乳中IgG 含量，目前尚無研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠第5 天（妊娠初期），母豬的血清IgG 含量顯著高于妊娠第35、110 天（妊娠中后期）。這與本實驗室前期在太湖豬妊娠母豬上的研究結(jié)果一致[6]。這一方面可能是母豬在妊娠初期免疫反應(yīng)增強，另一方面本試驗妊娠期日糧的營養(yǎng)水平高于配種前，而提高日糧營養(yǎng)水平有助于提高機體免疫力。李勇等[8]研究表明，高營養(yǎng)水平組妊娠早期初產(chǎn)母豬血清免疫球蛋白IgG、IgA 和IgM 含量顯著高于中低營養(yǎng)水平組。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在妊娠第5 天，淋巴組織AKT的mRNA 表達(dá)量以及脾臟組織FOXO1的mRNA 表達(dá)量都顯著高于妊娠第35、110 天；PI3K在脾臟中的mRNA表達(dá)量顯著高于乳腺和淋巴組織。AKT、FOXO1和PI3K是信號通路PI3K-AKT-FOXO1 中的幾個關(guān)鍵基因，對B 細(xì)胞的分化和發(fā)育起著調(diào)控作用。IgG 是由B細(xì)胞分泌的具有抗體活性的免疫球蛋白。成熟的B 細(xì)胞主要定居于淋巴結(jié)皮質(zhì)淺層的淋巴小結(jié)、脾臟的紅髓和白髓的淋巴小結(jié)內(nèi)。而PI3K-AKT-FOXO1 信號通路是已經(jīng)被證明了的信號通路[5]。具體是PI3K 被B 細(xì)胞發(fā)育和分化過程中的信號分子激活后，其活化底物PIP2和PIP3 作為第二信使，結(jié)合并激活多種細(xì)胞內(nèi)的靶蛋白，形成一個信號級聯(lián)復(fù)合物，通過磷酸化Thr308 和Ser473 位點激活A(yù)KT，激活的AKT 可使FOXO1 發(fā)生磷酸化而穿出細(xì)胞核，不能與DNA 結(jié)合而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，細(xì)胞得以存活[5]。PI3K-AKT-FOXO1 信號通路中幾個關(guān)鍵基因在妊娠初期的表達(dá)量高于妊娠中后期，正好與妊娠期第5 天血清IgG 含量較高相吻合，說明妊娠期血清IgG 的變化受此信號通路調(diào)控。今后可進(jìn)一步研究此信號通路或其中的基因受哪些遺傳因素或營養(yǎng)素影響，為IgG 的營養(yǎng)調(diào)控提供研究思路和理論基礎(chǔ)。