吳翠玲，謝 平，趙 卓，趙云輝，翟 博，柴浩晨,3，張明新*，王春昕*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130000；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林公主嶺 136100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100）

家畜繁殖性狀的高低決定了畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，其中產(chǎn)仔數(shù)是家畜繁殖性狀的重要數(shù)量性狀。但綿羊產(chǎn)羔數(shù)又是一個(gè)遺傳力低、難以改良的經(jīng)濟(jì)性狀。綿羊繁殖性能主要由下丘腦-垂體-性腺軸（HPGA）調(diào)節(jié)[1]。下丘腦產(chǎn)生的GnRH與其受體GnRHR結(jié)合后調(diào)節(jié)垂體前葉LH、FSH激素的合成和釋放。增加GnRH的分泌和GnRHR的數(shù)量會(huì)引起LH釋放高峰，而LH釋放高峰能促進(jìn)哺乳動(dòng)物排卵。其中LH與FSH化學(xué)本質(zhì)是糖蛋白，LH可促進(jìn)膽固醇在性腺細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為性激素。FSH能促進(jìn)母畜卵泡、顆粒細(xì)胞生長和雌激素合成。LH和FSH與受體結(jié)合后促進(jìn)卵泡生長成熟，誘導(dǎo)排卵，促進(jìn)黃體生成[2]。催乳素（PRL）在垂體嗜酸細(xì)胞中合成和分泌，可促進(jìn)母畜乳腺組織發(fā)育，調(diào)控雌激素分泌合成，抑制排卵。PRL 與其受體PRLR 結(jié)合后，通過JAK2/STAT5 信號系統(tǒng)傳導(dǎo)信息，保證目標(biāo)基因的正常表達(dá)。雌激素主要由卵巢的顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞分泌，其受體ESR廣泛存在雌性哺乳動(dòng)物組織中，雌激素與ESR 結(jié)合后與FSH、LH協(xié)同調(diào)控動(dòng)物發(fā)情。因此HPGA 中的生殖激素及其受體是影響綿羊產(chǎn)羔率的重要因素，可以作為影響綿羊產(chǎn)仔數(shù)的重要候選基因[3-4]。

新吉細(xì)毛羊是新疆畜牧科學(xué)院、新疆農(nóng)墾科學(xué)院和吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)院聯(lián)合培育的細(xì)毛羊品種，具有凈毛率高、羊毛綜合品質(zhì)優(yōu)異、適應(yīng)性強(qiáng)、遺傳性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但新吉細(xì)毛羊產(chǎn)羔率只有115%～120%。提高新吉細(xì)毛羊繁殖力是目前待解決的關(guān)鍵問題。本研究對新吉細(xì)毛羊GnRHR、LHR、FSH、PRLR、ESR5 個(gè)基因多態(tài)性進(jìn)行分析，旨在為新吉細(xì)毛羊育種工作中提高繁殖力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器 在吉林省查干花種畜場采集新吉細(xì)毛羊119 只母羊血樣各7～10 mL，-20℃保存。收集整理119 只新吉細(xì)毛羊頭三胎產(chǎn)羔數(shù)據(jù)；血液基因組柱式小量提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司，PCR Mixture 購自天根生物科技有限公司；主要儀器包括核酸蛋白檢測儀（Quawell，美國）、電泳儀（北京六一）、PCR 儀（伯樂，美國）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法

1.2.1 PCR 擴(kuò)增 用血液基因組柱式小量提取試劑盒提取DNA。根據(jù)NCBI 登錄號利用primer 5 軟件對5 個(gè)基因外顯子區(qū)設(shè)計(jì)引物，在上海生工生物工程股份有限公司合成引物，引物序列及相關(guān)信息見表1。PCR 反應(yīng)體系：PCR Mixture10 μL，上下游引物（10 mol/L）各0.5 μL，DNA 模板1.0 μL，加蒸餾水至20 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，退火30 s，退火溫度延伸1 min，34 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。4℃保存。PCR 產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 測序與統(tǒng)計(jì)分析 將每個(gè)基因PCR 產(chǎn)物分別混池送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，用DNASTAR 軟件對測序結(jié)果分析。對存在突變的基因片段PCR 產(chǎn)物分別測序。利用Excel 計(jì)算基因型頻率。利用GraphPad prism 6 軟件進(jìn)行基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 和PCR 產(chǎn)物檢測結(jié)果 提取的基因組DNA經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測OD260/280 值為1.8～2.1。說明提取的DNA 純度與質(zhì)量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求?；騊CR產(chǎn)物結(jié)果見圖1。由圖1 可知，得到產(chǎn)物與預(yù)期片段大小一致，無雜帶，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

圖1 5 個(gè)基因PCR 產(chǎn)物檢測結(jié)果

2.2 測序結(jié)果分析 測序發(fā)現(xiàn)FSHR基因不存在SNP 突變位點(diǎn)。GnRHR、LHR、PRLR、ESR基因突變位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2，4 個(gè)基因分型的測序結(jié)果如圖2～5。GnRHR基因存在2 個(gè)SNP 為cDNA 區(qū)發(fā)生的A505G、G720C突變，氨基酸分別發(fā)生G720C、R240S 改變。LHR基因存 在5 個(gè)SNP 為cDNA 區(qū)發(fā)生的T1262G、A1991G、C2012T、A2032T、T2041A 的突變，氨基酸分別發(fā)生D421A、Y664C、S671L、T678S、L681M 改 變。PRLR基因存在2 個(gè)SNP 為cDNA 區(qū)發(fā)生的A1263G、C1544G突變，氨基酸分別發(fā)生K387E、S480R 改變。ESR基因存在4個(gè)SNP為cDNA區(qū)發(fā)生的A106T、C181T、G612A、C735T 突變，其中A106T 突變導(dǎo)致氨基酸發(fā)生I36F 改變。后3 個(gè)為同義突變，未導(dǎo)致氨基酸的改變。

表1 引物信息表

表2 4 個(gè)基因突變位點(diǎn)信息表

圖2 GnRHR 基因測序結(jié)果

圖3 LHR 基因測序結(jié)果

圖4 PRLR 基因測序結(jié)果

圖5 ESR 基因測序結(jié)果

2.3 統(tǒng)計(jì)分析 新吉細(xì)毛羊GnRHR、LHR、PRLR、ESR4 個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型、基因型頻率計(jì)算結(jié)果以及不同基因型對新吉細(xì)毛羊產(chǎn)羔數(shù)的影響見表3。由表3 可知，除了GnRHR基因A505G 突變，LHR基因C2012T、A2032T 的突變，PRLR基因A1263G 突變，ESR基因C735T 突變只有2 種基因型，其他突變位點(diǎn)有3 種基因型。在新吉細(xì)毛羊群體4 個(gè)基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果中，只有ESR基因A106T 突變對新吉細(xì)毛羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著。其中 AA、AT、TT 3 種基因型個(gè)體的平均產(chǎn)羔數(shù)分別為1.391、1.101、1.417。AA 基因型、TT 基因型平均產(chǎn)羔數(shù)比AT 基因型分別多0.290、0.316 個(gè)(P＜0.05)。AA 型、TT 基因型平均產(chǎn)羔數(shù)之間差異不顯著(P＞0.05)。

3 討 論

數(shù)量性狀的表型值是由基因型值和環(huán)境值共同作用的結(jié)果。遺傳效應(yīng)是產(chǎn)生表型變異的內(nèi)因，環(huán)境效應(yīng)是表型變異的外部原因。近年來，為提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)，給養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐、選種選配提供理論依據(jù)。國內(nèi)外從遺傳效應(yīng)方面開展了大量多胎候選基因多態(tài)性的研究[5]。本實(shí)驗(yàn)研究了5 個(gè)關(guān)鍵的生殖激素受體基因：GnRHR、LHR、FSHR、PRLR、ESR。目前研究發(fā)現(xiàn)GnRHR基因?qū)S淮山羊、濟(jì)寧青山羊、古藺馬羊、川東山羊、西農(nóng)薩能奶山羊、貴州白山羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著[6-7]；FSHR基因?qū)Σ柹窖?、貴州黑山羊、遼寧絨山羊、薩能奶山羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著[8]；PRLR基因?qū)χ袊览ㄐ陆停┒嗵テ废?、小尾寒羊、關(guān)中山羊、波爾山羊、濟(jì)寧青山羊[9-10]產(chǎn)羔數(shù)影響顯著；ESR基因?qū)π∥埠?、湖羊、?jì)寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著[11]。

3.1GnRHR基因多態(tài)性分析GnRHR是G 蛋白耦聯(lián)受體家族成員，在垂體表面、淋巴細(xì)胞、乳腺、卵巢和前列腺中表達(dá)。GnRHR基因是分子標(biāo)記的研究熱點(diǎn)之一。國內(nèi)外對GnRHR基因多態(tài)性進(jìn)行了大量的研究[7,12]。本研究對GnRHR基因的全部外顯子共設(shè)計(jì)了4 對引物，在外顯子2、外顯子3 分別發(fā)現(xiàn)一個(gè)錯(cuò)義突變。其中G720C 突變位點(diǎn)只有一個(gè)樣本為CC 型，雖產(chǎn)羔數(shù)為2，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其結(jié)果可能存在偶然性，CC 型也有可能是新吉細(xì)毛樣雙羔性狀的標(biāo)記，需加大樣本量，進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2LHR基因多態(tài)性分析 目前的研究中，對綿羊LHR基因多態(tài)性研究較少，大多集中在LHβ基因上。因?yàn)長H基因的β亞基具有激素和物種特異性，識別、結(jié)合靶組織的特異受體，決定激素的生理特異性。但激素發(fā)揮作用必須依賴受體。LHR基因外顯子10、外顯子11 組成編碼區(qū)，本實(shí)驗(yàn)中主要對LHR基因外顯子11 多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)了5 個(gè)SNP 錯(cuò)義突變位點(diǎn)，均與新吉細(xì)毛羊產(chǎn)仔數(shù)無顯著相關(guān)。王利紅[13]利用PCRSSCP 技術(shù)對湖羊、晉中綿羊和陵川半細(xì)毛羊LHR基因外顯子11 的多態(tài)性進(jìn)行了研究，雖發(fā)現(xiàn)4 個(gè)突變位點(diǎn)，其中3 個(gè)突變位點(diǎn)A1991G、A2032T、T2041A 與新吉細(xì)毛羊上發(fā)現(xiàn)的相同，但均未對綿羊產(chǎn)仔數(shù)產(chǎn)生顯著影響，其結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相似。推測LHR不是新吉細(xì)毛羊產(chǎn)羔性狀的主效基因。

3.3FSHR基因多態(tài)性分析 國內(nèi)外大量研究表明FSHR基因多態(tài)性對動(dòng)物產(chǎn)羔數(shù)具有重要影響。本研究主要對FSHR基因外顯子9、外顯子10 多態(tài)性分析，共設(shè)計(jì)3 對引物，其中對FSHR基因外顯子10 設(shè)計(jì)2對引物，第一對引物PCR 產(chǎn)物全長1 271 bp，覆蓋全部外顯子。由于PCR 產(chǎn)物過長，未在實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖1 中表示。測序結(jié)果表明3 對引物的PCR 產(chǎn)物均未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。除了FSHR基因的外顯子9、外顯子10 以外，外顯子7 與5'端調(diào)控區(qū)也是該基因的研究熱點(diǎn)[14]。為最大挖掘新吉細(xì)毛羊多胎基因，應(yīng)對FSHR基因其他區(qū)域進(jìn)行深入研究。

表3 新吉細(xì)毛羊4 個(gè)基因的基因型頻率、對產(chǎn)羔數(shù)影響

3.4PRLR基因多態(tài)性分析PRLR是細(xì)胞因子受體家族成員。目前國內(nèi)外研究將PRLR基因作為豬繁殖性能的一個(gè)主效基因。豬的PRLR基因存在Alu I 酶切位點(diǎn)，其等位基因A 公認(rèn)為豬產(chǎn)仔性狀的優(yōu)勢基因型[15]。除此之外，PRLR基因與FSHβ、ESR、RBP4基因互作對豬繁殖性能有顯著影響。本研究對新吉細(xì)毛羊的PRLR基因外顯子10 多態(tài)性進(jìn)行了分析，共設(shè)計(jì)兩對引物，在引物P1、P2 的PCR 產(chǎn)物中各發(fā)現(xiàn)一個(gè)錯(cuò)義突變：A1263G、C1544G。在A1263G 突變中，不存在GG 基因型。張向楠利用PCR-SSCP 技術(shù)檢測4 個(gè)綿羊群體PRLR基因外顯子10，發(fā)現(xiàn)A1263G 突變存在GG 基因型，其基因型頻率極低。該結(jié)果與本研究結(jié)果相似，不同基因型對產(chǎn)羔數(shù)影響差異不顯著[16]。在C1544G 突變中，雖然不同基因型對新吉細(xì)毛羊產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著。但產(chǎn)羔數(shù)趨勢為CC 型＞CG 型＞GG 型。吳洪賓利用PCR-SSCP 技術(shù)在中國美利奴羊中發(fā)現(xiàn)相同突變位點(diǎn)，其GG 型3 月齡出生重比CC 型大約重1.7 kg。但產(chǎn)羔數(shù)趨勢與本研究結(jié)果一致，CC 型產(chǎn)羔數(shù)比GG 型約多0.3 只[17]。推測C 等位基因是綿羊多胎性狀優(yōu)勢基因。

3.5ESR基因多態(tài)性分析ESR基因被公認(rèn)為豬繁殖性狀的主效基因。ESR基因的Pvu II 多態(tài)位點(diǎn)與豬的產(chǎn)仔數(shù)存在緊密聯(lián)系[18]。綿羊中對ESR基因研究主要集中在外顯子1 和外顯子4 上。因此本研究對ESR基因外顯子1 和外顯子4 多態(tài)性進(jìn)行分析，共設(shè)計(jì)2 對引物。在P1 的PCR 產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)一個(gè)錯(cuò)義突變A106T。P2的PCR 產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)3 處同義突變：C181T、G612A、C735T。在A106T 的研究中發(fā)現(xiàn)AA 基因型與TT 基因型比AT 基因型產(chǎn)羔數(shù)約多0.3 只（P＜0.05），推測AA 型和TT 型為優(yōu)勢基因型。

綜上所述，在5 個(gè)生殖激素受體基因中發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)對新吉細(xì)毛羊的產(chǎn)羔數(shù)無顯著影響。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)新吉細(xì)毛羊BMPR-1B基因、BMP15基因、GDF9基因多態(tài)性對產(chǎn)羔數(shù)也無顯著影響[19-20]。同時(shí)單一基因的輔助育種效率低、世代間隔長，已經(jīng)不能滿足目前養(yǎng)羊業(yè)育種的需求。為提高新吉細(xì)毛羊產(chǎn)羔率，將進(jìn)一步在引進(jìn)多胎基因、基因聯(lián)合、幼雛超排[21]等方面提高產(chǎn)羔率。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)FSHR基因不存在突變位點(diǎn)，其余4 個(gè)基因存在13 個(gè)突變位點(diǎn)。GnRHR基因存在A505G、G720C 突變，LHR基因存在T1262G、A1991G、C2012T、A2032T、T2041A 突變，PRLR基因存在A1263G、C1544G突變，ESR基因存在A106T、C181T、G612A、C735T突變。在新吉細(xì)毛羊群體4 個(gè)基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果中，只有ESR基因A106T 突變對新吉細(xì)毛羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著。其中AA、AT、TT 3 種基因型個(gè)體的平均產(chǎn)羔數(shù)分別為1.391、1.101、1.417。AA 基因型、TT 基因型平均產(chǎn)羔數(shù)比AT 基因型分別多0.290、0.316個(gè)。AA 基因型、TT 基因型平均產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著。