陳煒昊，田志龍，孫 偉，儲(chǔ)明星*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

綿羊產(chǎn)羔數(shù)是衡量綿羊生產(chǎn)力的重要標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)羔性狀提高將為養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。然而，綿羊產(chǎn)羔性狀遺傳力低，易受各種環(huán)境因素和發(fā)育因素影響，使用常規(guī)育種手段難以滿足現(xiàn)代畜牧業(yè)對(duì)于產(chǎn)羔性狀改良的需求[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，標(biāo)記輔助選擇能夠從DNA 水平上對(duì)影響相關(guān)性狀的單個(gè)基因或染色體片段進(jìn)行分析，找到與對(duì)應(yīng)性狀位點(diǎn)相連鎖的標(biāo)記，對(duì)產(chǎn)羔性狀等低遺傳力性狀的遺傳改良效率有極大提高[2]。

晝夜節(jié)律是指生命活動(dòng)以24 h 左右為周期的變動(dòng)，又稱近日節(jié)律，是生命的基本特征之一，幾乎所有多細(xì)胞的生物活動(dòng)都受晝夜節(jié)律時(shí)鐘（生物鐘）調(diào)控影響[3]。自然狀態(tài)下，生物鐘接受光照、溫度等環(huán)境信號(hào)，調(diào)整自身節(jié)律保持與外界環(huán)境同步[4]。研究表明，綿羊?qū)儆诩竟?jié)性繁殖動(dòng)物，在光照逐漸縮短的秋冬季節(jié)開始性腺活動(dòng)，在冬春之交時(shí)結(jié)束，綿羊的繁殖過程具有明顯的節(jié)律性[5]，因此，晝夜節(jié)律對(duì)于綿羊的繁殖過程有一定的調(diào)控作用。

晝夜節(jié)律與基因的節(jié)律性表達(dá)有關(guān)，這些基因的表達(dá)量常受生物鐘調(diào)節(jié)并且伴隨晝夜循環(huán)發(fā)生規(guī)律性變化，維持晝夜節(jié)律基因稱為生物鐘基因[6]。目前哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)10 種以上的生物鐘基因，隱花色素基因（Cryptochrom，Cry）是核心成員之一，其屬于植物藍(lán)光受體基因家族和光解酶家族，是唯一的反饋環(huán)負(fù)調(diào)節(jié)因子，在生物節(jié)律中具有重要作用[7]。研究表明，Cry基因?qū)Σ溉閯?dòng)物卵巢功能有一定的影響，小鼠中2 種Cry基因亞型（Cry1、Cry2）的突變會(huì)導(dǎo)致生物鐘基因Per的節(jié)律性喪失[8]。Per基因在雌性哺乳動(dòng)物卵巢生物鐘的調(diào)節(jié)中起重要作用，參與調(diào)控類固醇激素釋放、排卵等多項(xiàng)繁殖相關(guān)生物學(xué)活動(dòng)[9]，從而影響繁殖功能。綜上，推測(cè)Cry基因可能對(duì)于綿羊繁殖性狀也有一定的影響，但目前綿羊上Cry基因與繁殖的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

本研究針對(duì)不同發(fā)情模式的綿羊品種（季節(jié)性發(fā)情和常年發(fā)情），利用本課題組前期重測(cè)序結(jié)果（尚未發(fā)表），篩選出與綿羊產(chǎn)羔性狀相關(guān)的候選基因Cry1基因g.175355119T＞C、g.175357583C＞T 位點(diǎn)與Cry2基因g.74126865C＞T 位點(diǎn)，探討3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性，為進(jìn)一步開展綿羊產(chǎn)羔機(jī)理的研究和分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 血樣采集及數(shù)據(jù)測(cè)定 380 只小尾寒羊血液樣本采自山東省鄆城縣誠(chéng)聯(lián)小尾寒羊種羊場(chǎng)，101 只湖羊血液樣本采自江蘇省徐州申寧羊業(yè)有限公司，52 只策勒黑羊血液樣本采自新疆和田市策勒縣，22 只灘羊血液樣本采自寧夏鹽池縣寧夏朔牧鹽池灘羊繁育有限公司，21只蘇尼特羊血液樣本采自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗民羊牧業(yè)有限責(zé)任公司，161 只草原藏羊血液樣本采自西藏當(dāng)雄縣，頸靜脈采血10 mL，迅速注入EDTA 抗凝管中，-20℃保存，并記錄小尾寒羊前三胎次的產(chǎn)羔數(shù)。

1.2 DNA 提取 使用血液DNA 試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取綿羊血液樣本DNA，Nano Drop2000 檢測(cè)DNA 樣本濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量。

1.3 基因分型 對(duì)Cry1基因g.175355119T＞C 和g.17535 7583C＞T 與Cry2基因g.74126865C＞T共3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種中進(jìn)行基因分型，采用Sequenom MassARRAY?SNP 技術(shù)進(jìn)行基因型檢測(cè)[10]。分型樣品為DNA，每個(gè)樣品需要量為20 μL，DNA 濃度為40～80 ng/μL。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel 統(tǒng)計(jì)綿羊Cry1、Cry2基因共3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne），并進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，配合模型進(jìn)行最小二乘分析：

其中，yijkl為產(chǎn)羔數(shù)的記錄值；μ 為總體均值；LSi為第i 個(gè)產(chǎn)羔季節(jié)的季節(jié)效應(yīng)（i=1，2，3，4）；Pj為第j個(gè)胎次的胎次效應(yīng)（j=1，2，3）；Gk為Cry1/Cry2基因第k 種基因型的基因型效應(yīng)；eijkl為隨機(jī)殘差效應(yīng)（服從標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布）。

采用IBM SPSS Statistics 19.0 軟件中一般線性模型程序單變量分析法對(duì)Cry1、Cry2基因3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的不同基因型和記錄的產(chǎn)羔數(shù)之間的差異顯著性進(jìn)行分析。P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性分析 根據(jù)基因分型結(jié)果，Cry1基因g.1753 55119T＞C 位點(diǎn)存在CC、CT 和TT 3 種基因型（圖1），g.175357583C＞T 位點(diǎn)存在TT、TC 和CC 3 種基因型（圖2）；Cry2基因g.74126865C＞T 位點(diǎn)存在CC、CT 和TT 3 種基因型（圖3）。

圖1 Cry1 基因g.175355119T＞C 位點(diǎn)分型結(jié)果

圖2 Cry1 基因g.175357583C＞T 位點(diǎn)分型結(jié)果

圖3 Cry2 基因g.74126865C＞T 位點(diǎn)分型結(jié)果

由表1 可知，綿羊Cry1基因g.175355119T＞C 位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種間差異極顯著，且在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種中T 均是優(yōu)勢(shì)等位基因；g.175357583C＞T位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種間差異不顯著，且在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種中C 均是優(yōu)勢(shì)等位基因。綿羊Cry2基因g.74126865C＞T 位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種間差異極顯著，且在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種中C 均是優(yōu)勢(shì)等位基因。

由表2 可知，綿羊Cry1基因g.175355119T＞C 位點(diǎn)和g.175357583C＞T 位點(diǎn)在6 個(gè)綿羊品種中均表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），g.175355119T＞C 位點(diǎn)在6 個(gè)綿羊品種中均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P＞0.05），g.175357583C＞T 位點(diǎn)在蘇尼特羊中處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)（P＜0.05），在其余5 個(gè)綿羊品種中則處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P＞0.05）。綿羊Cry2基因g.74126865C＞T 位點(diǎn)在6 個(gè)綿羊品種中均表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25），該位點(diǎn)在灘羊和草原型藏羊中處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)（P＜0.05），在其余4 個(gè)綿羊品種中則處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

2.2Cry1基因與Cry2基因3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系 由表3 可知，Cry1基因與Cry2基因3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)不同基因型與小尾寒羊不同胎次產(chǎn)羔數(shù)之間均無顯著關(guān)聯(lián)。

3 討 論

哺乳動(dòng)物生物鐘系統(tǒng)由位于下丘腦視交叉上核（SCN）的中樞生物鐘和各個(gè)組織中的外圍生物鐘組成，因此，生物鐘基因不僅僅在生物節(jié)律中發(fā)揮作用，在機(jī)體其他生物學(xué)功能中也發(fā)揮著重要作用[11]。Fahrenkrug等[12]于2006 年首次發(fā)現(xiàn)Clock、Cry等核心生物鐘基因在卵巢中的節(jié)律性表達(dá)，證實(shí)了卵巢生物鐘的存在。隨后大量研究表明生物鐘基因確實(shí)在雌性哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)生理過程中起重要作用[13-15]。Cry基因是核心生物鐘基因之一，由光介導(dǎo)調(diào)控[16]。Cry基因敲除小鼠在光誘導(dǎo)下抑制Per基因表達(dá)的能力有所減退或消失[17]，而Per基因表達(dá)量的改變會(huì)導(dǎo)致雌性哺乳動(dòng)物的生殖力改變[18]。此外，Cry1和Cry2雙突變的小鼠在正常光暗周期條件下表現(xiàn)出正常的節(jié)律性，但在全黑暗的條件下失去節(jié)律性[19]，綜上推測(cè)，Cry基因?qū)d羊等季節(jié)性發(fā)情的哺乳動(dòng)物繁殖功能有較大的影響。

本實(shí)驗(yàn)中群體遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Cry1基因g.17535 5119T＞C 位點(diǎn)和g.175357583C＞T 位點(diǎn)在6 個(gè)綿羊品種中均表現(xiàn)為中度多態(tài)，表明其在6 個(gè)綿羊品種中存在較大的選擇潛力。Cry2基因g.74126865C＞T 位點(diǎn)在6 個(gè)綿羊品種中均表現(xiàn)為低度多態(tài)，表明其在6 個(gè)綿羊品種中選擇潛力較小。Cry1基因g.175357583C＞T 位點(diǎn)在蘇尼特羊中處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)，Cry2基因g.74126865C＞T 位點(diǎn)在灘羊和草原型藏羊中處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)，可能是因?yàn)樽匀贿x擇或人工選擇對(duì)該位點(diǎn)分布影響較大，也可能與本研究選擇的羊品種數(shù)量較少有關(guān)。

表1 Cry1、Cry2 基因3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率

表2 Cry1、Cry2 基因3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在不同綿羊品種中的群體遺傳學(xué)分析

表3 Cry1 基因與Cry2 基因3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)各基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)

突變能顯著改變動(dòng)物表型，1982 年Davis 等在澳大利亞布魯拉綿羊品種發(fā)現(xiàn)的FecB 突變，就是在BMPRIB基因的第746 位發(fā)生A＞G 突變導(dǎo)致的，在1989 年時(shí)該突變正式被命名為FecB基因。1 個(gè)FecB基因拷貝可以增加排卵數(shù)1.3～1.6 枚和產(chǎn)羔數(shù)0.9～1.2只，2 個(gè)FecB基因拷貝可以增加排卵數(shù)2.73 枚和產(chǎn)羔數(shù)1.1～1.7 只[20]。Vitaterna 等[8]研究表明，Cry2突變會(huì)導(dǎo)致自由運(yùn)動(dòng)周期的延長(zhǎng)，Cry1突變則表現(xiàn)出自由運(yùn)動(dòng)周期的縮短，若Cry1和Cry2均發(fā)生突變，則生物鐘基因Per的節(jié)律性喪失，因此Cry基因多態(tài)性可能同樣對(duì)于綿羊繁殖有一定的影響，但目前相關(guān)報(bào)道較少，故探索綿羊Cry基因測(cè)序?qū)ふ移渑c產(chǎn)羔性狀關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)尤為重要。

綿羊Cry1基因g.175355119T＞C 和g.175357583C＞T位點(diǎn)發(fā)生于第3 外顯子，Cry2基因g.74126865C＞T 位點(diǎn)發(fā)生于第15 外顯子。3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)均屬于錯(cuò)義突變，Cry1基因g.175355119T＞C 位點(diǎn)導(dǎo)致第175 位氨基酸由異亮氨酸變?yōu)榈鞍彼?，g.175357583C＞T 位點(diǎn)導(dǎo)致第126 位氨基酸由纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼?，Cry2基因g.74126865C＞T 位點(diǎn)導(dǎo)致第325 位氨基酸由丙氨酸變?yōu)槔i氨酸。錯(cuò)義突變會(huì)導(dǎo)致蛋白變化并進(jìn)一步引起動(dòng)物表型的變化[21]，因此，3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的具體功能有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究表明，綿羊Cry1基因g.175355119T＞C、g.175357583C＞T 位 點(diǎn) 與Cry2基 因g.74126865C＞T 位點(diǎn)的多態(tài)性與小尾寒羊各胎產(chǎn)羔數(shù)無顯著關(guān)聯(lián)，可能都不是影響Cry1、Cry2基因功能的關(guān)鍵位點(diǎn)。