劉騰飛，章延嘉，蔣惠炎，馬雪云*

（1.華東師范大學(xué)生命醫(yī)學(xué)研究所，上海 201100；2.華東師范大學(xué)計算機(jī)科學(xué)與軟件工程學(xué)院，上海 201100）

隨著CRISPR/cas9 技術(shù)的廣泛應(yīng)用，基因工程小鼠在科研、生產(chǎn)當(dāng)中的使用也越來越普遍[1-4]，為了長期、穩(wěn)定的保存這些珍貴基因修飾小鼠資源，將小鼠精子冷凍，然后在需要時重新復(fù)蘇，重建該基因型的應(yīng)用也隨之增多[5-6]。以往研究表明，在小鼠資源重建過程中，相同密度和活力的小鼠精子，其體外受精率不盡相同，若僅以肉眼觀察精子密度和活力，往往不能準(zhǔn)確評估復(fù)蘇精子的受精能力，從而難以預(yù)測體外受精率，造成實驗資源、人力資源的浪費。Sohail 等[7]、Hirano 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，水牛和人類的新鮮精子在體外受精時的結(jié)果不同程度受到直線速度（VSL）、平均路徑速度（VAP）等影響。因此，對復(fù)蘇后小鼠精子的質(zhì)量進(jìn)行全面測定，較為準(zhǔn)確地推測精子的受精能力，對實際工作具有非常重要的意義。

SIRPA 是SIRP 家族中的一個典型的抑制免疫受體，其可以選擇性表達(dá)于髓系細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞膜表面，而體內(nèi)其他細(xì)胞則表達(dá)較少。對大量SIRPA 結(jié)構(gòu)缺失小鼠的研究顯示，SPRIA 沒有表現(xiàn)出明顯的發(fā)育障礙或者生長遲緩現(xiàn)象，該基因可參與細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)，但對于生物體內(nèi)胚胎發(fā)育或是胚后發(fā)育并不起關(guān)鍵作用[9]。HTR6 是與精神分裂癥、阿爾茲海默癥有關(guān)，對該基因型小鼠模型的生殖無影響。根據(jù)對目前研究結(jié)果的追蹤，均未發(fā)現(xiàn)以上2 種基因型對小鼠生殖發(fā)育的影響。本研究選取SIRPA 和HTR6 2 種基因型小鼠的冷凍精子，運用計算機(jī)輔助分析技術(shù)（CASA）準(zhǔn)確捕捉復(fù)蘇精子頭部運動圖像，對精子動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行采集和分析，找出影響復(fù)蘇精子受精能力的主要因素，進(jìn)而達(dá)到對小鼠品系進(jìn)行快速重建的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 小鼠精子來源 華東師范大學(xué)調(diào)控生物學(xué)重點實驗室小鼠精子庫：選取SIRPA、HTR6 2 個基因型的冷凍精子進(jìn)行本實驗，以上基因型背景品系均為C57BL/6小鼠。

1.1.2 供卵雌鼠 雌鼠為華東師范大學(xué)閔行校區(qū)實驗動物中心[SCXK（滬）2016-0004]自行繁育，均為野生型C57BL/6 小鼠品系，年齡為3～4 周齡。

1.1.3 試劑與儀器 凍精復(fù)蘇液和體外受精液（HTF）均為本實驗室配制[10]。注射用孕馬血清激素（PMSG）、注射用人絨毛膜促性腺激素（hCG）均為寧波第二激素廠生產(chǎn)。邁朗精子分析儀：購自南寧松景天倫生物科技有限公司，儀器型號為ML-16011826。

1.1.4 主要參數(shù) 精子分析儀所測主要參數(shù)及計算方法：在計算機(jī)分析過程中，所選各視野內(nèi)的被檢精子個數(shù)之和為精子總數(shù)；精子密度為精液中的單位體積內(nèi)的精子個數(shù)；精子活率為活動精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比；精子活力率為前向運動精子占總精子數(shù)的百分比；VSL（μm/s）是精子在受檢時間范圍內(nèi)所走直線距離對時間的平均值；曲線速度（VCL，μm/s）是精子沿其實際運動曲線，所走路程對時間的平均值；VAP（μm/s）為精子沿其空間平均移動軌跡運動時，所走路程對時間的平均值；側(cè)擺幅度（ALH，μm/s）是精子在運動過程中，實際軌跡相對其平均移動軌跡的偏離幅度。鞭打頻率（BCF，鞭打次數(shù)/s）為精子曲線運動軌跡越過其平均路徑軌跡的次數(shù)對時間的平均值；直線性（LIN）用于表明精子實際所走路線的曲折程度，計算方法為VSL/VCL；平均移動角度（MAD）為精子沿其曲線軌跡瞬間轉(zhuǎn)折角度的絕對值之和對時間的平均值；前向性（STR）用于表明精子平均移動軌跡的曲折程度，計算方法為VSL/VAP。

1.2 實驗方法 本實驗選用同一批次的同基因型雄鼠各6 只，每只小鼠精子凍存10 支麥管，每次復(fù)蘇使用1支麥管的精子。實驗中，每只小鼠隨機(jī)復(fù)蘇5 支麥管，故每個基因型重復(fù)30 次，多次重復(fù)復(fù)蘇從而保證主成份分析的準(zhǔn)確性。

1.2.1 精子復(fù)蘇 從液氮中取出麥管，在空氣中搖動15～30 s，投入37℃水浴中完全溶解，30 s 后剪開麥管，將精子及凍存液吹入1 mL 精子復(fù)蘇液中，2 500 r/min離心3 min，棄去上清，保留50 μL 液體，再將EP 管底部精子重新懸浮。

1.2.2 精子動力參數(shù)檢測 將樣品加入精子計數(shù)板，用精子分析儀分析精子相關(guān)參數(shù)，每個基因型精子測試3 次。

1.2.3 卵子的獲得 取3～4 周齡雌鼠，腹腔注射PMSG 7.5 IU，48 h 后注射hCG 7.5 IU，14～16 h 后，頸椎脫臼處死，無菌取出輸卵管，體視顯微鏡下找到膨大部，釋放卵團(tuán)，將卵團(tuán)挑入100 μL 已預(yù)熱的用礦物油覆蓋的HTF 中，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.4 受精過程 精子復(fù)蘇后取適量精液加入含有卵團(tuán)的受精滴中，調(diào)整精子濃度為1×107～5×107個/mL，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，完成受精過程。

1.3 計算受精率 精卵結(jié)合6 h 后，將受精滴中的卵子用 37℃的 HTF 溶液清洗干凈，置于KSOM 培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，18 h 后，統(tǒng)計2 細(xì)胞胚胎數(shù)量與參與受精的卵的總量并計算受精率，結(jié)果如表1 所示。每個基因型重復(fù)30 次。受精率=2 細(xì)胞胚胎數(shù)量/參與受精的卵的總量。

表1 復(fù)蘇精子體外受精胚胎發(fā)育情況 個

1.4 統(tǒng)計分析 利用SPSS 23.0 版軟件對分組數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，分別對各基因型的各因素數(shù)值進(jìn)行KMO 檢測和Bartlett 檢驗，其中KMO 檢測中，當(dāng)KMO 值＞0.7，表明數(shù)據(jù)具有較好的相關(guān)性，可以做因素分析，如果KMO 值＜0.5，則不適合做因素分析；Bartlett 檢驗中，sig 值的顯著性表示是否需要拒絕變量相互獨立的假設(shè)，即因素是否適合因素分析。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 精子復(fù)蘇后動力學(xué)參數(shù)及結(jié)果 由表2 可知，基因型SIRPA 和基因型HTR6 的體外受精率分別為51.97%和70.08%。

2.2 KMO 檢測和Bartlett 檢驗 分別對表2 中基因型的各因素數(shù)值進(jìn)行KMO 檢測和Bartlett 檢驗，得出基因型SIRPA 的KMO 值為0.778（＞0.7），Bartlett 檢驗結(jié)果P值（0.000）＜0.01，基因型HTR6 的KMO 值為0.771（＞0.7），Bartlett 檢驗結(jié)果P值（0.000）＜ 0.01，表明以上2 種基因型所測數(shù)據(jù)均適合做相關(guān)性分析。

2.3 碎石圖確定影響體外受精率精子主要動力因素個數(shù)碎石圖可粗略估計有幾個因素對受精率具有相關(guān)性。由圖1 可知，隨著因素序號的增大，特征根迅速降低，VCL、VAP、ALH、BCF、LIN、MAD、STR 的特征根基本沒有變化且趨于水平直線，由此可以基本認(rèn)定2 種基因型均有4 個因素與受精率有較強(qiáng)相關(guān)性，但碎石圖不能確定具體是哪4 個因素，需要進(jìn)一步分析。

表2 精子復(fù)蘇后動力參數(shù)及受精率

圖1 基因型SIRPA（A）和基因型HTR6（B）碎石圖

2.4 散點圖確定影響體外受精率精子的主要動力因素將表2 中各基因型的精子參數(shù)繪制散點圖，R2值結(jié)果如表3，R2值越大，說明該因素對受精率影響越緊密，選取其中4 個較大值因素，分別為VSL、VCL、VAP和ALH。

表3 精子復(fù)蘇后各參數(shù)散點圖R2值

2.5 卡方估值比較主要動力學(xué)因素 由散點圖分析確定VCL、VAP、VSL 和ALH 是對復(fù)蘇后精子受精率影響的4 個主要因素，利用卡方估值進(jìn)行分析，基因型SIRPA 中VCL、VSL、ALH、VAP 的P 值分別為0.049、0.047、0.049、0.049，基 因 型HTR6 中VCL、VSL、ALH、VAP 的P值分別為0.028、0.021、0.028、0.028。由以上結(jié)果分析，2 個基因型各自VSL 的P值均最小，說明該因素對受精率的影響較大。因此判斷，VSL 與受精率有更強(qiáng)的相關(guān)性，VCL、VAP 和ALH 對受精率的影響相同，對受精率的影響相對較小。

3 討 論

CASA 是近幾十年出現(xiàn)的分析技術(shù)，與人工評估技術(shù)相比，具有更快捷、更準(zhǔn)確的特點，目前已較廣泛地應(yīng)用于科研及生產(chǎn)領(lǐng)域。本實驗以2 種基因型C57BL/6小鼠冷凍精子為研究對象，精子復(fù)蘇后，于受精前，利用CASA 進(jìn)行了精子動力學(xué)分析，檢測出精子的11 個動力學(xué)參數(shù)。2 種基因型精子的KMO 值均大于0.7，Bartlett 檢驗值為0.000，表明2 種基因型精子所測數(shù)據(jù)均與其受精率有較好的相關(guān)性，可以進(jìn)行進(jìn)一步分析。碎石圖顯示，11 個因素中，2 個基因型精子均有4 個因素與受精率存在較強(qiáng)的相關(guān)性，隨后分析出VSL、VAP、VCL 和ALH 這4 個因素對精子受精率影響較大，其中VSL 影響最大，VCL、VAP 和ALH 相對較弱。

Sohail 等[7]研究顯示，測試水牛精子的VCL、VSL、VAP 可以預(yù)測受精率，而BCF 與受精率關(guān)系不大。Hirano 等[8]研究顯示，在人類不育癥的IVF-ET 治療中評估新鮮精子的VSL、ALH、VCL 和STR，可以在一定程度上對受精進(jìn)行預(yù)測。另有研究顯示，人類體外受精中卵裂率高組VCL、VAP 明顯高于卵裂率低組[11]。胡庭溪等[12]通過分析3 頭公牛精子的相關(guān)參數(shù)發(fā)現(xiàn)VAP、VCL、ALH 分別與其IVF 受精率、胚胎的卵裂率具有顯著的相關(guān)性。同樣，Ben 等[13]也認(rèn)為以上參數(shù)與精子受精能力相關(guān)，有促進(jìn)精卵結(jié)合的作用。精子的運動能力強(qiáng)可保證其準(zhǔn)確到達(dá)受精部位以穿透卵丘細(xì)胞及透明帶[14]。以上結(jié)果與本實驗結(jié)果相似。結(jié)合本研究中所得數(shù)據(jù)，綜合人類及牛的精子受精動力學(xué)因素分析結(jié)果，可以初步認(rèn)為不同物種的精子在受精時所受精子自身因素影響相似。本實驗中基因型SIRPA 受精率為51.97%，而基因型HTR6 受精率為70.08%，2 種基因型精子受精率相差較大，排除試驗條件及人員的影響，推測基因型不同，精子的受精率也會不同，即基因型對轉(zhuǎn)基因小鼠精子體外受精率有影響。有研究表明，在體外受精液中添加ATP、GSH 可提高受精率，這可能與增加能量物質(zhì)和還原性物質(zhì)可以提高精子的VSL、VAP、VCL 和ALH 有關(guān)，至于為何VSL 對受精率影響最大，及如何通過提高VSL 來提高受精率，需要進(jìn)行更深入的研究。