尹 娟 龐 智

南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院消化系疾病與營養(yǎng)研究中心(215008)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)包括克羅恩病(Crohn’s disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病因?qū)W不明，目前普遍認(rèn)為環(huán)境、微生物等因素誘導(dǎo)遺傳易感個(gè)體的腸道對微生物產(chǎn)生異常免疫應(yīng)答導(dǎo)致的慢性炎癥與IBD發(fā)病有關(guān)。遺傳易感無菌動物并不表現(xiàn)出結(jié)腸炎癥狀，表明微生物是IBD發(fā)生的必要條件[1]。隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，近年涌現(xiàn)出大量研究應(yīng)用16S宏基因組測序分析CD患者消化道中復(fù)雜的微生物組成和菌群失調(diào)現(xiàn)象。同時(shí)，關(guān)于真核生物中的機(jī)會致病真菌與IBD發(fā)病和慢性化相關(guān)的報(bào)道也日益增多。與非CD患者相比，CD患者的抗真菌抗體水平更高，甚至在疾病確診前即已表現(xiàn)出差異[2-3]，支持這一群體存在真菌菌群失調(diào)的觀點(diǎn)。本文重點(diǎn)從病原學(xué)和宏基因組學(xué)角度綜述近期真菌在成人CD患者中的研究進(jìn)展。

一、腸道真菌與宿主免疫系統(tǒng)的關(guān)聯(lián)

腸道真菌種類受宿主遺傳背景、衛(wèi)生狀況、生活方式、抗菌藥物的使用等多種因素影響，最常出現(xiàn)于人體腸道的真菌為青霉屬、念珠菌屬和曲霉屬[4]。研究[5]表明食物來源對腸道真菌菌群組成有顯著影響，主食動物性食物與主食植物性食物的人群腸道真菌菌群差異顯著。盡管在DNA水平檢測，真菌菌群在腸道微生物中的占比僅約0.1%～1%，但其平均體積為細(xì)菌的100倍以上，腸道真菌的生物總量及其對腸道微生態(tài)的作用可能被大大低估[6]。

定植于腸道的真菌與宿主免疫系統(tǒng)間的相互作用對維持宿主腸道健康極為重要。固有免疫受體如C型凝集素受體(dectin-1、dectin-2、mincle等)、Toll樣受體(TLR2、TLR4等)可識別真菌胞壁β-1,3-葡聚糖。Dectin-1可通過CARD9激活細(xì)胞內(nèi)信號，誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1、Th17細(xì)胞分化以及相關(guān)炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生[7]；通過與腸道微生物間的作用調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)分化，從而調(diào)節(jié)腸道免疫穩(wěn)態(tài)[8]。關(guān)于真菌通過C型凝集素受體在IBD中作用的研究較為多見。Dectin-1缺失小鼠對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎更為敏感；dectin-1基因多態(tài)性(CLEC7A)與UC病情重癥化顯著相關(guān)[9]。高表達(dá)dectin-1以及其他C型凝集素受體的CX3CR1+單核吞噬細(xì)胞可應(yīng)對多數(shù)共生真菌，通過Syk信號通路啟動適應(yīng)性抗真菌免疫應(yīng)答，該細(xì)胞功能受損的小鼠更易被念珠菌屬誘導(dǎo)發(fā)生腸道疾?。籆D患者存在CX3CR1編碼基因錯義突變，并與抗真菌應(yīng)答受損相關(guān)[10]。因此，腸道真菌菌群穩(wěn)態(tài)與腸黏膜免疫平衡密切相關(guān)。

二、二代測序技術(shù)的發(fā)展對腸道真菌微生態(tài)研究的促進(jìn)作用

近20年來，不依賴于培養(yǎng)法的二代測序技術(shù)的發(fā)展使研究消化道中難以培養(yǎng)的微生物成為可能。對真菌的分析系針對其高度保守的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1或ITS2)。不同測序平臺使用的策略各有其優(yōu)勢。Illumina測序平臺使用的循環(huán)可切除終止測序法策略同聚體錯誤率低；454焦磷酸測序法可測序1 000 bp的長片段，解除了測序的長度限制；而SOLiD(sequencing by oligonucleotide ligation and detection，寡核苷酸連接和檢測測序)方法使大規(guī)模平行測序成為可能。Illumina測序的準(zhǔn)確性大于99.5%，其他連接酶法測序如SOLiD準(zhǔn)確性大于99.95%[11]。研究者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的測序平臺。

運(yùn)算軟件的不斷發(fā)展，使計(jì)算出差異小于1%的OTU(operational taxonomic units，運(yùn)算分類單位)成為可能，MED(minimum entropy decomposition)還可分辨近緣物種的真正差異和測序誤差[12]。生態(tài)學(xué)分類概念被用于區(qū)分微生物種群，如alpha多樣性分析的shannon和simpson指數(shù)被用于計(jì)算樣本內(nèi)物種多樣性，而beta多樣性分析可評估樣本間多樣性。未來16S與ITS測序策略的整合，加之對復(fù)雜的細(xì)菌與真菌混合群體數(shù)據(jù)分析方法的發(fā)展，將促進(jìn)對真菌在健康和疾病中所起作用的評估工作[13]。

三、真菌在CD發(fā)病機(jī)制中的作用

應(yīng)用二代測序技術(shù)檢測CD發(fā)病過程中的腸道菌群組成，可發(fā)現(xiàn)患者腸道細(xì)菌與真菌菌群組成多樣性相關(guān)，細(xì)菌與真菌菌群失調(diào)亦相關(guān)[13-14]。與健康對照者相比，CD患者結(jié)腸活檢標(biāo)本的真菌菌群生物多樣性更大[15]，炎癥黏膜真菌豐度和生物多樣性增加更為顯著[16]；糞便真菌菌群中白念珠菌、棒曲霉、新型隱球菌數(shù)量顯著增多，且糞便真菌生物多樣性與血清C反應(yīng)蛋白(CRP)和CD活動指數(shù)呈顯著正相關(guān)[16]。Hoarau等[17]發(fā)現(xiàn)，CD患者與其無病一級親屬相比，熱帶念珠菌豐度顯著增高，并與CD生物學(xué)標(biāo)志物抗釀酒酵母抗體(ASCA)水平呈正相關(guān)，但真菌總體生物多樣性減少。Sokol等[18]分析了IBD患者的糞便樣本，發(fā)現(xiàn)其擔(dān)子菌門/子囊菌門比值較健康個(gè)體升高，釀酒酵母占比降低，白念珠菌占比增高。Liguori等[19]的研究顯示，CD患者黏膜相關(guān)菌群中銀耳亞綱Cystofilobasidiaceae科家族和光滑念珠菌過量，炎癥黏膜真菌總體數(shù)量增多，炭角菌目存在于炎癥黏膜，釀酒酵母和指甲絨黑粉類酵母則存在于非炎癥黏膜。這些真菌只是路過菌還是與腸黏膜免疫相關(guān)，亟待深入研究。但上述研究均支持成人CD患者腸道真菌生物組成豐度大于健康人群的觀點(diǎn)。

人體內(nèi)真菌生態(tài)失調(diào)與內(nèi)穩(wěn)態(tài)是一個(gè)動態(tài)過程，這一動態(tài)變化很可能比真菌感染更常發(fā)生，從而對宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生持續(xù)影響[20-21]。近期研究表明共生真菌白念珠菌和釀酒酵母可馴化宿主免疫系統(tǒng)，該作用與真菌胞壁多糖幾丁質(zhì)有關(guān)。分離自白念珠菌的幾丁質(zhì)可通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10(IL-10)抑制炎癥反應(yīng)[22]。以釀酒酵母幾丁質(zhì)預(yù)處理小鼠，可誘導(dǎo)小鼠對抗白念珠菌引起的致命感染；經(jīng)特定釀酒酵母菌株處理的人單核細(xì)胞，由脂多糖(LPS)刺激引起的促炎細(xì)胞因子IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)分泌增多，殺菌能力增強(qiáng)；分離自CD患者糞便樣本釀酒酵母的幾丁質(zhì)含量顯著高于環(huán)境中釀酒酵母的幾丁質(zhì)含量，可能在腸黏膜促炎細(xì)胞因子分泌中起調(diào)控作用[23]。

共生真菌在淋巴細(xì)胞再循環(huán)和誘導(dǎo)宿主免疫耐受中發(fā)揮重要作用。人類出生后RALDH+樹突細(xì)胞(DCs)從固有層被招募至腸系膜和外周淋巴結(jié)的過程依賴于共生真菌。以抗真菌藥物處理SPF級小鼠，可導(dǎo)致其外周淋巴結(jié)中的RALDH+DCs顯著減少；而予小鼠外源性熱帶念珠菌可增加其外周淋巴結(jié)中的RALDH+DCs數(shù)量[24]。由此推測生命早期腸道微生物群對免疫系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要。有研究[25]報(bào)道，健康人群外周血中存在真菌特異性Treg細(xì)胞擴(kuò)增，其表型和功能特征均與胸腺來源的Treg細(xì)胞相同。小鼠小腸派伊爾結(jié)DCs識別白念珠菌誘導(dǎo)免疫耐受，此過程依賴于真菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的2,3吲哚胺雙加氧酶(2,3 indoleamine dioxy-genase， IDO)[26]。免疫耐受DCs產(chǎn)生的IDO促進(jìn)色氨酸代謝成為活化T細(xì)胞芳烴受體的底物，從而促進(jìn)Treg細(xì)胞產(chǎn)生[20，27]。根據(jù)上述結(jié)論推測，CD患者白念珠菌等共生真菌比例變化可調(diào)控外周血Treg細(xì)胞數(shù)量和免疫耐受。

目前對真菌在IBD發(fā)病中的作用機(jī)制并不明確，但研究[9]證實(shí)dectin-1基因與UC疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，dectin-1缺失小鼠對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎易感。CD患者抗真菌抗體水平升高，ASCA IgG和IgA被認(rèn)為是CD診斷和疾病進(jìn)程預(yù)測較好的生物學(xué)標(biāo)志物[2-3]。基于全基因組關(guān)聯(lián)分析的研究[28]發(fā)現(xiàn)IBD與宿主抗真菌免疫相關(guān)。鑒于成人CD患者存在明顯的真菌菌群失調(diào)，共生真菌對腸黏膜免疫系統(tǒng)具有重要調(diào)節(jié)作用，生命早期免疫系統(tǒng)發(fā)育受真菌影響顯著，因此易感個(gè)體童年期真菌菌群組成對生命后期疾病風(fēng)險(xiǎn)的評估具有重要意義。亟待開展更多基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究深入探索真菌菌群失調(diào)與CD發(fā)展間的因果關(guān)系。

四、CD患者腸道真菌菌群失調(diào)與現(xiàn)行治療方案的關(guān)系

現(xiàn)行CD早期有效治療方案為使用抗體靶向特定炎癥相關(guān)分子以減輕慢性炎癥，TNF-α、IL-12/23和白細(xì)胞黏附分子為常用治療靶點(diǎn)。靶向TNF-α的抗體主要有英夫利西單抗、阿達(dá)木單抗、賽妥珠單抗，優(yōu)特克單抗則是首個(gè)靶向IL-12/23 p40亞基的抗體。條件致病真菌如白念珠菌相關(guān)免疫反應(yīng)有TNF-α、IL-17、IL-23等參與[29-30]。因此上述CD治療方案與真菌感染(組織胞漿菌病、酵母菌病、球孢子菌病以及其他機(jī)會致病真菌感染)有關(guān)[31]。臨床試驗(yàn)中，與安慰劑相比，抗IL-17A單抗(蘇金單抗)治療組患者糞便炎癥介質(zhì)增多，發(fā)生黏膜皮膚念珠菌病的風(fēng)險(xiǎn)增加[32]。納入14篇文獻(xiàn)共1 524例IBD患者的系統(tǒng)綜述表明，IBD患者最常見的真菌感染為念珠菌屬感染(903例)，多數(shù)感染發(fā)生于抗TNF-α治療6個(gè)月內(nèi)[33]。

迄今尚無IBD抗真菌治療的臨床試驗(yàn)開展。理論上，靶向IL-17、IL-23、IL-22、TNF-α細(xì)胞因子途徑可減輕促炎反應(yīng)和急性黏膜損傷，但也同時(shí)導(dǎo)致共生真菌減少，機(jī)會致病真菌豐度增加，這為IBD患者臨床檢測到病原真菌提供了合理的解釋。特別是Th17細(xì)胞因子，如IL-22可直接調(diào)節(jié)上皮抗微生物相關(guān)基因表達(dá)，包括腸上皮細(xì)胞Reg3γ以及Paneth細(xì)胞等的抗微生物產(chǎn)物。這些黏膜分泌物減少可促進(jìn)黏膜表面真菌生長和定植。雖然上述現(xiàn)象并未被常規(guī)檢測到，但已有研究數(shù)據(jù)表明某些免疫靶向治療可致真菌負(fù)荷增加。由此可提出下述假設(shè)：IBD相關(guān)免疫反應(yīng)部分是由病原真菌所驅(qū)動，特定治療方案可能緩解消化道對病原真菌的免疫反應(yīng)[13]。

五、益生真菌在IBD治療中的應(yīng)用

共生真菌對宿主免疫功能具有重要調(diào)節(jié)作用。目前在CD的臨床治療中，布拉酵母菌已被用于緩解腸道炎癥的輔助治療。近年來，其機(jī)制研究取得了一定進(jìn)展。作為一種益生真菌，布拉酵母菌可增強(qiáng)宿主腸道對病原菌的免疫反應(yīng)，限制CD、UC以及難辨梭菌結(jié)腸炎等病理性炎癥反應(yīng)[34]。布拉酵母菌培養(yǎng)上清液可直接抑制CD患者由LPS誘導(dǎo)的髓樣DCs及其促炎細(xì)胞因子分泌[35]。有研究[34]發(fā)現(xiàn)，布拉酵母菌可提高腸道總IgA水平。在小鼠結(jié)腸炎模型中，喂飼布拉酵母菌可減輕組織學(xué)炎癥反應(yīng)，抑制白念珠菌在腸道定植[36]。

另一見諸報(bào)道的益生真菌為乳酒假絲酵母?？诜榫萍俳z酵母可緩解實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，伴腸系膜淋巴結(jié)Treg細(xì)胞和調(diào)節(jié)性DCs增多以及固有層Th17細(xì)胞減少[37]。隨著高通量二代測序技術(shù)的發(fā)展，未來研究或可關(guān)注腸黏膜或糞便樣本菌群分析中益生真菌的鑒定及其臨床應(yīng)用。

六、糞菌移植(FMT)與IBD

FMT最早系用于治療復(fù)發(fā)性難辨梭菌感染，可重建腸道菌群內(nèi)穩(wěn)態(tài)[38]。目前關(guān)于FMT在IBD治療中的應(yīng)用已成為研究熱點(diǎn)，但結(jié)論不一。一項(xiàng)關(guān)于FMT治療IBD的系統(tǒng)綜述顯示，17.4%～60.4%的IBD患者經(jīng)FMT治療后獲得臨床緩解，UC患者和CD患者的臨床緩解率分別為22%和60.5%[39]。目前關(guān)于FMT用于UC患者的研究更多。最近一項(xiàng)多中心、雙盲、隨機(jī)、安慰劑對照試驗(yàn)表明，多供體FMT可誘導(dǎo)活動性UC臨床緩解和內(nèi)鏡改善，F(xiàn)MT后微生物多樣性增加并持續(xù)[40]。當(dāng)前關(guān)于FMT供體與受體糞便微生態(tài)的研究聚焦于細(xì)菌組成，尚無研究關(guān)注真菌組成在FMT治療前后微生物多樣性變化中的貢獻(xiàn)。隨著真菌菌群分析方法的改進(jìn)，真菌分析將在分析FMT供體與受體腸道微生態(tài)變化中占據(jù)重要地位。

七、小結(jié)與展望

IBD病因?qū)W研究強(qiáng)烈支持如下觀點(diǎn)：環(huán)境因素的改變可影響宿主腸道微生態(tài)，增加遺傳易感宿主的IBD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，繼而影響疾病進(jìn)展。現(xiàn)有研究多聚焦于細(xì)菌菌群失調(diào)在IBD發(fā)病中的作用，但越來越多的研究數(shù)據(jù)表明真菌菌群組成在此過程中亦發(fā)生顯著變化，消化道中存在著更為復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境成分的相互作用。綜上所述，人類消化道中真菌菌群多樣性的改變以及特定真菌種類豐度的變化在IBD發(fā)病中起有一定作用，未來IBD相關(guān)研究應(yīng)更加關(guān)注真菌在IBD病因中的潛在作用。