趙 俊，田會(huì)玲，宋洪濤，王 旭，羅 彤，艾麗雅，房毓敏，趙江豪，賽音朝克圖，李志剛△

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029; 2.內(nèi)蒙古呼和浩特市內(nèi)蒙古人民醫(yī)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010; 3.內(nèi)蒙古自治區(qū)國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065； 4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方學(xué)院,廓坊 065001)

抑郁癥(depression)被歸類為精神疾病。 臨床主要表現(xiàn)為持續(xù)性抑郁、孤獨(dú)、焦慮、認(rèn)知功能障礙和高自殺率，這給患者和家庭帶來(lái)嚴(yán)重的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。 與此同時(shí)，調(diào)查數(shù)據(jù)顯示全球約有3.5億人患有抑郁癥，而且人數(shù)正在逐年增加[3-4]。 世界衛(wèi)生組織(WHO)預(yù)測(cè)到2030年抑郁癥將成為全球慢性疾病的第一殺手，威脅人類的心理健康[5]。 選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)如鹽酸氟西汀通常是用于治療抑郁癥的首選藥物，但臨床上約有50%的患者對(duì)治療無(wú)效[6]。 因此，替代治療方案可能提供新的抗抑郁藥策略[7]。

針灸治療抑郁癥療效確切并可以緩解抗抑郁藥物的副作用[8]，臨床治療應(yīng)用日益受到關(guān)注。近年來(lái)，針刺治療抑郁癥的機(jī)制探討逐步深入，根據(jù)抑郁癥發(fā)病的“細(xì)胞因子假說(shuō)”[9]，認(rèn)為慢性應(yīng)激因素刺激后可以引起免疫激活，釋放各種炎性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生發(fā)展[10]。此外，20世紀(jì)科學(xué)家還提出了抑郁癥的“單胺類假說(shuō)”，認(rèn)為抑郁癥的發(fā)生與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)單胺類遞質(zhì)如去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)水平或功能下降有關(guān)[11]。已有臨床研究發(fā)現(xiàn)，針刺百會(huì)、足三里等穴能顯著降低抑郁癥患者血清IL-6和TNF-α的水平[12-13]；針刺肝俞、腎俞等穴能顯著升高女性更年期抑郁癥患者血清NE、DA及HIAA的含量[14]。另有報(bào)道[15]指出百會(huì)穴(GV20)對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)有良性調(diào)節(jié)作用；印堂穴(GV29)同樣對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)也有調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)釋放，參與抑郁癥的發(fā)生。百會(huì)與印堂被認(rèn)為是治療抑郁癥的首要穴位[16]，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)電針百會(huì)、印堂穴對(duì)抑郁癥治療有效[17]，并且電針能調(diào)節(jié)中樞炎癥因子及神經(jīng)遞質(zhì)水平[18-19]，但電針對(duì)血清中炎性細(xì)胞因子和單胺類物質(zhì)的影響尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬采用慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激(CUMS)抑郁大鼠模型，觀察電針刺激百會(huì)、印堂穴后對(duì)血清IL-6 、TNF - α 、NE 、DA及HIAA含量的影響，探討電針治療抑郁癥的可能機(jī)制及潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，8～9周齡，體質(zhì)量為160～220 g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。將所有大鼠置于溫度(22±2)℃和相對(duì)濕度(35±2)%的環(huán)境中，飼養(yǎng)室通風(fēng)良好且自然光充足，條件相對(duì)穩(wěn)定，飼養(yǎng)7天以適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及藥物 IL-6和TNF-α ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品：去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)(美國(guó)Sigma公司);色譜級(jí)甲醇(fisher)、L-半胱氨酸(amresco)、磷酸二氫鈉(merck)、辛烷磺酸鈉(Alfa)、乙二胺四乙酸二鈉(Alfa)、氯化鉀(Alfa)都是進(jìn)口分析純(美國(guó)Sigma公司);氟西汀(禮來(lái)蘇州制藥有限公司，批號(hào):J20170022)。一次性針灸針(北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)；韓氏電針儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)有限公司，LH202)；超聲破碎儀(美國(guó)SONICS)；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)HERAEUS)。

1.2 分組、造模及干預(yù)方法

為確保實(shí)驗(yàn)造模刺激之前基線特征的一致性，在應(yīng)激前1天測(cè)量了體質(zhì)量，并進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(Elevated plus maze,EPM)。踢除4只基線特征不一致的大鼠，將具有相似體重和EPM基線特征的24只大鼠隨機(jī)分為4組，即正常組、模型組、氟西汀組與電針組(每組6只)。除應(yīng)激刺激期外，所有大鼠可自由進(jìn)食和飲水。 干預(yù)均于每日上午10點(diǎn)進(jìn)行，模型組、氟西汀組和電針組每日隨機(jī)接受1種應(yīng)激刺激方式，造模期為第8～36天，共28天。見(jiàn)圖1。

圖1 CUMS刺激方式造模實(shí)驗(yàn)時(shí)間表

本研究結(jié)合慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激建立CUMS模型[20]。應(yīng)激刺激方法包括4℃冷水游泳5 min；禁或禁食24 h；晝夜顛倒24 h；束縛3 h；夾尾3 min；籠位傾斜24 h；潮濕環(huán)境24 h。為了確保刺激方式不可預(yù)測(cè)，每天的刺激順序隨機(jī)抽簽產(chǎn)生，且同一刺激不連續(xù)應(yīng)用，共持續(xù)28天。

除正常組大鼠群養(yǎng)以外，其余各組單籠飼養(yǎng)。正常組自由飲水食，不接受任何刺激。模型組每日接受隨機(jī)慢性應(yīng)激造模刺激處理后，不接受任何治療。 氟西汀組每日應(yīng)激刺激后1 h，用生理鹽水配制1 mg/mL的氟西汀稀釋藥液，按照2 mg/kg灌胃給藥。電針組應(yīng)激1 h后，固定于自制鼠套中，參照張露芬主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》選取相當(dāng)于人體解剖部位的 “印堂”和“百會(huì)”穴[21]。局部消毒后，選用0.25 mm×25 mm一次性針灸針，針刺深度約為5～10 mm，且針體與皮膚保持15°夾角，“印堂”穴針尖向下傾斜，“百會(huì)”穴針尖向上傾斜，小幅度輕捻轉(zhuǎn)后，針柄接韓氏電針儀，頻率2 Hz，電流強(qiáng)度1 mA，連續(xù)波，刺激強(qiáng)度維持在頭部肌肉輕微振動(dòng)且不嘶叫為宜，持續(xù)20 min，每天1次，治療28天。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(EPM) 評(píng)價(jià)動(dòng)物抑郁樣行為的首要裝置，利用動(dòng)物對(duì)新高懸敞開(kāi)臂環(huán)境的好奇心和恐懼心理(開(kāi)臂)以及嗜暗天性(閉臂)，形成動(dòng)物的探究與回避的矛盾沖突來(lái)考察動(dòng)物的抑郁焦慮狀況[22]。實(shí)驗(yàn)將每只大鼠于十字迷宮中央平臺(tái)處放入，使其頭部正對(duì)其中1個(gè)封閉臂，釋放后計(jì)時(shí)5 min并記錄以下指標(biāo):進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)(Open arm entry,OE)、 進(jìn)入封閉臂次數(shù)(Close arm entry,CE)、進(jìn)入開(kāi)放臂時(shí)間(Open arm time,OT)和進(jìn)入封閉臂時(shí)間(Close arm time,CT)。根據(jù)上述指標(biāo)計(jì)算：開(kāi)放臂的次數(shù)比例OE(%)=OE/(OE+CE)×100%；和開(kāi)放臂停留時(shí)間比例OT(%)=OT/(OT+CT)×100%。

1.3.2 ELISA法檢測(cè)血清IL-6 和TNF-α含量 實(shí)驗(yàn)第36天，大鼠稱重后予10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔麻醉后迅速腹主動(dòng)脈取血5 mL，靜置后離心(4℃，3 000 rpm，15 min)，取上清液于-80℃保存?zhèn)溆?。每只大鼠取?0 μL，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)定血清IL-6和TNF-α的水平。

1.3.3 HPLC法檢測(cè)血清中NE、DA和5-HIAA含量 HPLC設(shè)備包括Agilent 1 100 LC高效液相色譜儀和DECADE II SDC電化學(xué)檢測(cè)器。 Skyam?的Atlantis C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，3 μm)。使用由0.1 mol/L KH2PO4和甲醇(10∶1，V/V；pH=3)組成的流動(dòng)相進(jìn)行色譜分離，流速為0.2 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)電極電位為500 mV。

配制裂解液：稱取(0.05 g 0.01%L-半胱氨酸，0.1 g 0.5 mmol/L EDTA二鈉，9 mL 0.2 mol/L高氯酸)并用超純水稀釋成100 mL的血清裂解液。每只大鼠取樣250 μL，將裂解液以1∶5的比例加入血清中(即50 μL血清中加入10 μL裂解液)。冰浴條件下超聲破碎10 s。4℃，15 000 r/min離心30 min，取上清液-80℃凍存以析出蛋白，檢測(cè)前再15 000 r/min離心30 min，取上清液用0.22 μm耐酸過(guò)濾器過(guò)濾后，將10 μL注入HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析。待檢血清單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA和5-HIAA，各神經(jīng)遞質(zhì)濃度含量以ng/L表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(EPM)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)應(yīng)激前，各組大鼠在開(kāi)放臂的次數(shù)比例(OE%)和開(kāi)放臂停留時(shí)間比例(OT%)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)應(yīng)激后，與正常組比較，模型組OE%和OT%明顯下降(P<0.01)，表明造模成功；與模型組比較，氟西汀組大鼠OE%和OT%值上升(P<0.01或P<0.05)，電針組OE%和OT%值亦存在顯著差異(P<0.01),提示經(jīng)過(guò)氟西汀和電針干預(yù)后可以改善這種焦慮抑郁樣行為。見(jiàn)表1。

表1 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)開(kāi)放臂次數(shù)和停留時(shí)間比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與氟西汀組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2 ELISA檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6和TNF-α含量均升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)氟西汀和電針治療后，與模型組比較，氟西汀組IL-6和TNF-α含量均降低(P<0.01),電針組IL-6和TNF-α含量同樣顯著降低(P<0.01)；與氟西汀組比較，電針組IL-6和TNF-α含量減少，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 ELISA檢測(cè)結(jié)果

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與氟西汀組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.3 HPLC檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清NE含量顯著降低(P<0.05)。經(jīng)氟西汀和電針治療后，與模型組比較，電針組DA含量變化最為顯著(P<0.01)，NE、5-HIAA含量升高，接近正常水平，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與模型組比較，氟西汀組5-HIAA含量升高(P<0.01)；與氟西汀組相比，電針組DA、5-HIAA含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖2。

表3 HPLC檢測(cè)結(jié)果

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與氟西汀組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

圖2 NE、DA、5-HIAA檢測(cè)結(jié)果

3 討論

抑郁癥通常被認(rèn)為是具有復(fù)雜病理生理學(xué)和不同信號(hào)傳導(dǎo)途徑的多系統(tǒng)疾病。中醫(yī)認(rèn)為百會(huì)和印堂為督脈的要穴，百會(huì)主一身之宗，百神之會(huì)，且與足太陽(yáng)膀胱經(jīng)穴相交會(huì)，通過(guò)調(diào)節(jié)太陽(yáng)經(jīng)(心俞、肝俞、脾俞、腎俞；神堂、魂門、意舍)等背俞穴而與五臟六腑關(guān)系密切，故能協(xié)調(diào)陰陽(yáng)、調(diào)和五臟精神、通調(diào)髓海，有百脈朝宗之效。而印堂穴能安神醒腦、益智定驚，正所謂“經(jīng)脈所過(guò)，主治所及”，與百會(huì)穴能一同發(fā)揮“近治功效”，因此本研究選取督脈上的印堂、百會(huì)穴治療神志疾病，符合中醫(yī)治病必求于本之說(shuō)[23]。

臨床研究[24]表明慢性應(yīng)激可以引發(fā)患者抑郁樣行為，電針治療對(duì)抑郁癥有一定的改善作用[16]。抑郁癥的“細(xì)胞因子假說(shuō)”，認(rèn)為長(zhǎng)時(shí)間的慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)損傷，免疫系統(tǒng)會(huì)在應(yīng)激下持續(xù)激活，單核-巨噬細(xì)胞活動(dòng)增加，致炎性細(xì)胞因子(IL-6、TNF-α等)釋放增加[25]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，致炎因子IL-6、TNF-α等在抑郁模型體內(nèi)的水平顯著升高，該研究結(jié)論得到普遍認(rèn)同[26]。臨床研究[27]發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者存在免疫系統(tǒng)功能的改變，中樞炎性因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等表達(dá)上調(diào)。另有報(bào)道[28]指出抑郁癥患者血清致炎性因子(IL-6、TNF-α)水平明顯增高，且隨著病情的加重炎性因子水平也隨之升高。以上研究提示中樞和外周IL-6、TNF-α水平的變化可能反映抑郁癥的嚴(yán)重程度。

另有報(bào)道[29]指出慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)中調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的小分子多肽——細(xì)胞因子分泌異常，炎性細(xì)胞因子通過(guò)對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)等方面的影響，可引起神經(jīng)遞質(zhì)的水平過(guò)低，神經(jīng)發(fā)生減少，進(jìn)而導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生[30]。既往研究發(fā)現(xiàn)，核因子-κB可介導(dǎo)外周炎性細(xì)胞因子進(jìn)入中樞，結(jié)合相應(yīng)的受體，通過(guò)影響神經(jīng)遞質(zhì)的合成及釋放進(jìn)而影響抑郁癥的發(fā)生發(fā)展[31]。

本研究結(jié)果表明慢性應(yīng)激造模后，大鼠開(kāi)放臂的次數(shù)比例(OE%)和停留時(shí)間比例(OT%)明顯下降，模型大鼠表現(xiàn)抑郁焦慮樣行為，這與臨床抑郁癥患者癥狀極為相似[32]，提示本實(shí)驗(yàn)成功建立抑郁模型。本次研究結(jié)果表明慢性應(yīng)激可以引起抑郁大鼠血清IL-6和TNF-α含量顯著升高，既往研究發(fā)現(xiàn)[33]，IL-6、TNF-α含量升高與抑郁癥發(fā)生呈正相關(guān)，本次研究與該研究結(jié)論相似。電針治療可以顯著降低模型大鼠血清中上述炎性細(xì)胞因子水平，這與針刺可以顯著降低慢性應(yīng)激抑郁大鼠血清IL-6和TNF-α含量[34]結(jié)果一致。血清中的單胺物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果顯示，應(yīng)激后模型組大鼠血清NE、DA和5-HIAA含量降低，經(jīng)氟西汀和電針治療后，NE、5-HIAA含量有不同程度的升高，氟西汀治療后5-HIAA較電針治療變化明顯，而電針治療后5-HIAA接近正常水平，這可能是抗抑郁藥物副作用的緣故?？挂钟羲幬镏饕且罁?jù)單胺能遞質(zhì)缺乏假說(shuō)研發(fā)而成，是通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的抗抑郁效應(yīng)[35]，特別是多巴胺受體，在抑郁癥的發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，經(jīng)氟西汀治療后，大鼠DA含量升高，與藥物的功效趨勢(shì)相符合。較氟西汀治療效果而言，電針治療后DA含量變化最為顯著，這與針刺可以顯著增加DA表達(dá)結(jié)果一致[36]，表明電針治療在改善DA含量方面較單純氟西汀治療更為有效。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電針治療可以恢復(fù)慢性輕度不可預(yù)測(cè)的輕度應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠抑郁樣行為，降低應(yīng)激抑郁大鼠血清IL-6和 TNF-α的表達(dá)，緩解外周免疫炎癥反應(yīng)，同時(shí)還能促進(jìn)機(jī)體單胺類神經(jīng)物質(zhì)，特別是DA的分泌，這可能是電針發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)的機(jī)制之一。