胡選生，李 娜，李丹青，閆小葉，田 歡

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

毛酸漿(PhysalispubescensL.)為茄科酸漿屬草本植物，別稱為洋菇娘、黃菇娘等，其帶漿果的宿萼或全草稱作燈籠草，藥用歷史遠久[1]。毛酸漿中富含黃酮類類化合物，具有抗腫瘤、消炎、抗氧化、利尿、免疫抑制等生理活性[2]。大孔樹脂具有吸附量大、效率高、解吸容易、不溶于酸堿、穩(wěn)定性較強、比表面積較大、可重復(fù)利用、壽命長等優(yōu)點，是一種有效的分離純化黃酮方法[3,4]。研究表明HP20大孔樹脂對黃酮類物質(zhì)的分離、富集能力較好[5～7]。目前關(guān)于毛酸漿總黃酮分離純化工藝的研究較少, 研究利用HP20大孔樹脂通過單因素和正交試驗優(yōu)化毛酸漿總黃酮的純化工藝，為毛酸漿總黃酮的進一步開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛酸漿購于遼寧省丹東市，干燥粉碎后備用；HP20大孔吸附樹脂購于日本三菱化學(xué)公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購于西安晶博生物科技有限公司; 其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

DHG-9123A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；UV-1100型紫外可見分光光度計(上海美析儀器有限公司)；TS-110X50型恒溫振蕩器(上海博珍儀器設(shè)備制造廠)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；LGJ-10D型冷凍干燥機(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司)；HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業(yè)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 HP20大孔吸附樹脂的預(yù)處理 取適量HP20大孔樹脂，用95%乙醇浸泡24 h，濕法裝柱，用蒸餾水沖洗至無醇味。然后依次用5% HCL、5% NaOH浸泡24 h，除去樹脂中堿類、酸類化合物，最后用蒸餾水沖洗至中性，晾干備用[8]。

1.3.2 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品配制成不同的濃度, 采用硝酸鋁顯色法顯色后于分光光度計的510 nm波長處測吸光度[9,10], 以槲皮素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y = 4.9737x+0.0036，R2= 0.9989。

1.3.3 毛酸漿總黃酮的制備 稱取20 g毛酸漿粉末→95%乙醇提取→ 90℃水浴→合并濾液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→蒸發(fā)至膏狀→冷凍干燥。制得毛酸漿總黃酮提取物。

1.3.4 靜態(tài)吸附單因素試驗 主要有:

(1)吸附時間對吸附率的影響。稱取HP20大孔樹脂6份2 g于100 mL錐形瓶中，加入30 mL pH為6的總黃酮提取液(1 mg·mL-1)，在30℃、120 r·min-1條件下分別振蕩吸附4、4.5、5、5.5、6 h，測定溶液中剩余黃酮濃度，按照公式(1)計算吸附率，確定最佳吸附時間。

(1)

式中：E—吸附率，%；

C0—起始液黃酮濃度，mg·mL-1；

C1—吸附后溶液中的黃酮濃度，mg·mL-1。

(2)吸附溫度對吸附率的影響。準(zhǔn)確稱取預(yù)處理的6份HP20樹脂2 g于100 mL錐形瓶中，每瓶中精密量取30 mL pH為6的總黃酮提取液(1 mg·mL-1)，分別置于20、25、30、35、40℃的恒溫水浴搖床上，在120 r·min-1條件下震蕩吸附5 h后，根據(jù)(1)計算樹脂吸附率，確定最佳吸附溫度。

(3)樣品液pH值的影響。準(zhǔn)確稱取各2 g HP20大孔樹脂于100 mL錐形瓶中，各加入30 mL pH為4、5、6、7、8的總黃酮粗提液(1 mg·mL-1)，于30℃、120 r·min-1條件下震蕩吸附5 h后，根據(jù)公式(1)計算樹脂吸附率，確定樣品液的最佳pH值。

1.3.5 靜態(tài)解吸單因素試驗 主要有:

(1)解吸液乙醇體積分數(shù)對解吸率的影響。稱取HP20大孔樹脂2 g于100 mL錐形瓶中，加入30 mL黃酮提取液(1 mg·mL-1)，在30℃、120 r·min-1條件下振蕩吸附5 h，測定吸光度值。將吸附后的黃酮提取液倒出，用純水對樹脂進行三次洗滌，除去水分。

稱取吸附飽和的大孔樹脂2 g，分別加入30 mL體積分數(shù)為60%、65%、70%、75%、80%的乙醇溶液，于在25℃、120 r·min-1條件下解吸3 h，按照公式(2)計算解吸率，確定最佳乙醇體積分數(shù)。

(2)

式中：D—大孔吸附樹脂的解吸率，%；

C2—解吸24 h后解吸溶液中的總黃酮質(zhì)量濃度，mg·mL-1；

V1—黃酮溶液體積，mL；

V2—解吸液體積，mL。

(2)解吸液乙醇體積對解吸率的影響。稱取吸附飽和的HP20大孔樹脂2 g于100 mL錐形瓶中，分別加入60、65、70、75、80 mL的70%乙醇，于在25℃、120 r·min-1條件下解吸3 h，按照公式(2)計算解吸率，確定最佳乙醇體積。

(3)解吸時間對解吸率的影響。稱取吸附飽和的HP20大孔樹脂2 g于100 mL錐形瓶中，分別加入70 mL的70%乙醇，于在25℃、120 r·min-1條件下解吸2、2.5、3、3.5、4 h，按照公式(2)計算解吸率，確定最佳解吸時間。

1.4 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，對影響吸附率和解吸率的主要因素進行正交試驗, 確定最佳吸附參數(shù)和解吸參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

圖1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y = 0.003x + 0.0143，R2= 0.9983。結(jié)果表明槲皮素在 50～250 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 吸附時間對吸附率的影響 如圖2所示：在5 h之前吸附率隨時間增加變化較大, 之后基本保持不變, 表明吸附達到平衡，因此選擇吸附時間為4.5、5、5.5 h進行正交設(shè)計試驗。

圖2 吸附時間對吸附率的影響

2.2.2 吸附溫度對吸附率的影響 由圖3可知，當(dāng)溫度從20℃上升至40℃，吸附率呈現(xiàn)先逐漸升高后降低的趨勢，當(dāng)溫度為30℃ 時，樹脂的吸附率最大，可達90.2%。因此選擇吸附溫度為25、30、35 ℃進行正交設(shè)計試驗。

圖3 吸附溫度對吸附率的影響

2.2.3 樣品液的pH對吸附率的影響 如圖4所示：當(dāng)樣品液的pH從3到6時，樹脂吸附率呈上升趨勢，當(dāng)樣品液的pH為6時吸附率已經(jīng)到最高，再隨著樣品液pH的增長，解吸率下降。當(dāng)pH較高時，黃酮酚羥基分離H+，氫鍵相互作用減少，從而導(dǎo)致出現(xiàn)較低的吸附能力[11]。因此選取樣品液的pH為5、6、7進行正交設(shè)計試驗。

圖4 樣品液的pH對吸附率的影響

2.2.4 乙醇體積分數(shù)對解吸率的影響 如圖5所示：當(dāng)乙醇體積分數(shù)從60%增長到70%時，解吸率逐漸上升。即乙醇體積分數(shù)上升到70%時，解吸率呈現(xiàn)出最大，之后隨著乙醇體積分數(shù)的增加，解吸率下降?？赡苁怯捎谝掖俭w積分數(shù)的增加會減少其中的水分含量，從而導(dǎo)致一些水溶性黃酮類物質(zhì)不能被溶解[12]。因此選取乙醇體積分數(shù)分別為65%、70%、75%進行正交設(shè)計試驗。

圖5 乙醇體積分數(shù)對解吸率的影響

2.2.5 乙醇體積對解吸率的影響 如圖6所示：隨著洗脫液體積的增加，解吸率逐漸上升，當(dāng)解吸液體積增加到70 mL時，解吸率達到最高值，之后逐漸趨于平緩。因此選取解吸液體積為65、70、75 mL進行正交設(shè)計試驗。

圖6 乙醇體積對解吸率的影響

2.2.6 解吸時間對解吸率的影響 如圖7所示：在3 h之前解析率隨時間增加而增加，之后基本保持不變，表明解吸完全。因此選取解吸時間為2.5、3.0、3.5 h進行正交設(shè)計試驗。

2.3 正交試驗

正交試驗的因素和水平見表1, 表2；正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表3，表4。

表2 大孔樹脂解吸毛酸漿總黃酮工藝正交試驗因素水平

由表3可知，根據(jù)R值大小, 得出因素影響的主次順序為吸附時間>吸附溫度>樣品液pH值。正交試驗的最優(yōu)組合為A2B2C2, 即吸附時間為5 h，吸附溫度為30℃，樣品液的pH為6。驗證試驗結(jié)果表明，A2B2C2工藝條件下的吸附率為88.4%。

由表4可知，根據(jù)R值大小, 得出因素影響的主次順序為乙醇體積分數(shù)>乙醇體積>解吸時間。正交試驗的最優(yōu)組合為A2B2C2, 即乙醇體積分數(shù)70%，乙醇體積70 mL，解吸時間3 h。驗證試驗結(jié)果表明，A2B2C2工藝條件下的解吸率為90.2%。

表3 大孔樹脂吸附毛酸漿總黃酮工藝正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表4 大孔樹脂解吸毛酸漿總黃酮工藝正交試驗設(shè)計及結(jié)果

3 結(jié)論

HP20型大孔吸附樹脂能夠純化毛酸漿總黃酮，最佳吸附工藝條件為吸附時間5 h，吸附溫度30℃，樣品液的pH6。此工藝條件下的吸附率為88.4%；最佳解吸工藝條件為乙醇體積分數(shù)70%，乙醇體積70 mL，解吸時間3 h，此工藝條件下的解吸率為90.2%。該工藝為制備毛酸漿總黃酮、深度開發(fā)毛酸漿提供了一定的參考依據(jù)。