彭蕓花， 李道寬 ，肖曼 ，何帥

(1 海南醫(yī)學(xué)院 第二附屬醫(yī)院,?？?571000；2 蘭州大學(xué) 第一醫(yī)院,蘭州 730000；3 海南醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)及分子生物學(xué)教研室，?？?571000)

卵巢癌是嚴(yán)重威脅女性生命的生殖道惡性腫瘤[1]，據(jù)統(tǒng)計(jì)2015年中國(guó)卵巢癌新發(fā)病例為5.21萬(wàn),死亡人數(shù)高達(dá)2.25萬(wàn)[2]. 卵巢癌起病隱匿，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多為晚期，晚期卵巢癌易盆腹腔廣泛轉(zhuǎn)移、原發(fā)或繼發(fā)化療多藥耐藥及易復(fù)發(fā)，導(dǎo)致死亡率高居不下，5年生存率仍徘徊于40%[3-4]. 中藥因其作用多靶點(diǎn)、多功效、副作用低、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)在腫瘤治療中發(fā)揮著不可替代的作用. 鴉膽子(Bruceajavanica)性味苦、寒，具有清熱解毒、治療瘧疾等功效，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤作用[5]，但作用機(jī)制不明. 本研究利用生物信息學(xué)大數(shù)據(jù)分析的優(yōu)勢(shì)，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建有效藥物成分-基因靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖，初步預(yù)測(cè)出鴉膽子治療卵巢癌的潛在作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究提供了參考和依據(jù).

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform TCMSP:http:/ /ibts.hkb.edu.hk/LSP/tcmsp.php；a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of Traditional Chinese Medicine BATman-TCM：http://bionet.ncpsb.org/batman‐tcm/；Traditional Chinese Medicine Information Database TCM‐ID:nus.edu.sg/group/TCMsite/Default.aspx)、TCMSP、TCM-ID、NPSS 、Swiss Target Prediction: (http://swisstargetprediction.ch/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.disgenet.org/)、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)、結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(UniProt:http://www.Uniprot.org/).

1.2 藥物成分的篩選及潛在基因靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

通過(guò)TCMSP、BATman-TCM、TCM‐ID、NPSS檢索出鴉膽子的成分，再根據(jù)成分藥物動(dòng)力學(xué)(absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME) 參數(shù)[6]設(shè)置條件，對(duì)符合藥物口服生物利用度 (oral bioavailability，OB) ≥30% ，類藥性值(drug-likeness，DL)≥0.18 的成分進(jìn)行篩選，得出鴉膽子的有效活性成分. 再通過(guò) TCMSP 平臺(tái)、NPASS數(shù)據(jù)庫(kù)、TCM-ID數(shù)據(jù)庫(kù)、Swiss Target Prediction平臺(tái)預(yù)測(cè)出上述有效活性成分作用的潛在基因靶點(diǎn)，應(yīng)用Cytoscape3.6.0軟件對(duì)其進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建出成分-潛在基因靶點(diǎn)的網(wǎng)狀關(guān)系圖.

1.3 人卵巢癌相關(guān)基因的檢索

通過(guò)DRUGBANK、OMIM及DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出與人卵巢癌顯著相關(guān)的基因，獲得所有已知的與卵巢癌有關(guān)的基因靶點(diǎn).

1.4 關(guān)鍵基因靶點(diǎn)的挖掘及基因功能分析

通過(guò)比對(duì)1.2和1.3檢索出的基因，篩選出共同基因，Cytoscape3.6.0進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖. 在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO生物學(xué)功能分析，得出關(guān)鍵基因靶點(diǎn)的生物學(xué)功能.

1.5 通路富集分析

對(duì)上述關(guān)鍵基因靶點(diǎn)映射到DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG富集信號(hào)通路分析，找到主要的信號(hào)通路.

2 結(jié)果

2.1 鴉膽子活性成分及潛在基因靶點(diǎn)

檢索出鴉膽子的化學(xué)成分67種，根據(jù)OB和DL 值等 ADME參數(shù)(OB≥30%，DL≥0.18)篩選到具有生物活性的成分15種，根據(jù)分子式、Smile等化學(xué)結(jié)構(gòu)最后確認(rèn)12種化合物(表1). 通過(guò)NPSS預(yù)測(cè)出與這些活性成分作用有關(guān)的基因靶點(diǎn)有11個(gè)、BATMAN-TCM有91個(gè)、TCM-ID有113個(gè)，經(jīng)篩選去除相同的成分后得到最終成分185個(gè)，利用TCMSP靶點(diǎn)及模型預(yù)測(cè)技術(shù)再次預(yù)測(cè)與鴉膽子活性成分相關(guān)作用的靶點(diǎn)，排除重復(fù)后共獲得124個(gè)靶點(diǎn). 利用 Cytoscape3.6.0軟件制作成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖1).

表1 鴉膽子有效活性成分和類藥性值Tab.1 Effective active ingredients and DL of Brucea javanica

橢圓形為化合物，菱形為靶點(diǎn)圖1 成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Component-targets network

2.2 關(guān)鍵基因靶點(diǎn)的挖掘

通過(guò)DRUGBANK、OMIM及DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出與人卵巢癌發(fā)生、發(fā)展顯著相關(guān)的基因靶點(diǎn)有622個(gè)，其中與預(yù)測(cè)的鴉膽子成分潛在基因靶點(diǎn)交集的基因有33個(gè)，作為藥物-疾病共同的關(guān)鍵基因靶點(diǎn).

2.3 基因功能分析

將33個(gè)基因靶點(diǎn)在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO生物學(xué)功能分析(P<0.05)，得出鴉膽子活性成分與卵巢癌交集的靶基因的生物學(xué)功能包括：調(diào)節(jié)胰島素受體信號(hào)通路、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)的調(diào)節(jié)、調(diào)控轉(zhuǎn)錄及基因表達(dá).交集靶基因的細(xì)胞學(xué)功能主要作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜及核周.交集靶基因的分子功能包括：蛋白激酶活性、血小板活化、肽酰絲氨酸磷酸化、蛋白激酶活性、鈣依賴性蛋白激酶C活性、ATP結(jié)合、蛋白質(zhì)磷酸化、金屬離子結(jié)合及酶結(jié)合等(表2).

表2 鴉膽子作用于卵巢癌的 GO分析結(jié)果
Tab.2 GO analysis ofBruceajavanicaon ovarian cancer

分類GO ID名稱P值生物功能0044212transcription regulatory region DNA binding5.65E-040008283cell proliferation0.0080859270045893positive regulation of transcription, DNA-templated0.0228805590007165signal transduction0.0429887090010628positive regulation of gene expression0.0357701610035556intracellular signal transduction9.44E-050046627negative regulation of insulin receptor signaling pathway1.57E-040008285negative regulation of cell proliferation0.0265052050005886plasma membrane0.0015834720048471perinuclear region of cytoplasm0.0041439220005622intracellular0.005294442細(xì)胞功能0005829cytosol0.0061796160005783endoplasmic reticulum0.0117248360004697protein kinase C activity1.33E-100030168platelet activation6.64E-070018105peptidyl-serine phosphorylation9.27E-070004672protein kinase activity1.76E-060004698calcium-dependent protein kinase C activity2.31E-060005524ATP binding1.49E-04分子功能0006468protein phosphorylation1.52E-040004674protein serine/threonine kinase activity0.0015834720008270zinc ion binding0.0050898680003682chromatin binding0.0256319980019899enzyme binding4.40E-050046872metal ion binding0.006713230043234protein complex0.024502495

2.4 通路富集分析

將33個(gè)交集靶點(diǎn)映射到DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析(P<0.05)，交集靶基因主要涉及的14條信號(hào)通路包括：TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)，癌癥的途徑，mTOR信號(hào)通路，VEGF信號(hào)通路，ErbB信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路，Wnt信號(hào)通路及鈣信號(hào)通路等(表3).

表3 鴉膽子作用于卵巢癌的KEGG分析結(jié)果Tab.3 KEGG analysis of Brucea javanica on ovarian cancer

2.5 成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

利用STRING構(gòu)建鴉膽子靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)，線條的粗度與蛋白間的關(guān)聯(lián)度成正比，線條越粗，關(guān)聯(lián)度越大(圖3).

圖2 鴉膽子作用于卵巢癌的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network graph of Brucea javanica on ovarian cancer

圖3 鴉膽子作用于卵巢癌的成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-信號(hào)通路圖Fig.3 Components-key targets-signal pathway diagram of Brucea javanica on ovarian cancer

圖中可看beta-sitosterol、luteolin、brusatol等有效生物活性成分包含TP53、ERBB2、PRKCA、PRKCG、TNF等12個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)分布于不同的代謝通路，如VEGF 信號(hào)通路，ErbB信號(hào)通路及Wnt信號(hào)通路等. 由此表明，鴉膽子從多種途徑對(duì)卵巢癌產(chǎn)生抑制作用機(jī)制.

3 討論

卵巢癌早期臨床表現(xiàn)隱匿，診斷困難，晚期疾病進(jìn)展快，易發(fā)生腹腔廣泛轉(zhuǎn)移及化療多藥耐藥，易復(fù)發(fā). 目前雖然手術(shù)技術(shù)不斷提高，化療方案越來(lái)越規(guī)范，化療新藥的副作用也逐漸減低，但卵巢癌的總體生存率無(wú)明顯改善[3]，仍是嚴(yán)重威脅女性生命的主要生殖道惡性腫瘤. 有研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子油乳注射液作為傳統(tǒng)中藥鴉膽子的提取成分，與順鉑聯(lián)用能夠逆轉(zhuǎn)A2780/DDP細(xì)胞順鉑耐藥[7]，并通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性來(lái)抑制DNA的復(fù)制、翻譯及轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)體內(nèi)干擾素的合成誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]，但具體機(jī)制不明.

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析藥物有效成分—作用靶點(diǎn)—信號(hào)通路—疾病關(guān)系，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模型，發(fā)現(xiàn)鴉膽子的多個(gè)有效成分能夠作用于多個(gè)靶點(diǎn)和信號(hào)通路，發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)；不同成分的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路互相交集，又各有主次；信號(hào)通路之間通過(guò)共同靶點(diǎn)相連接，顯示出不同成分間的多靶點(diǎn)協(xié)同作用，符合中藥學(xué)的特點(diǎn)，形成一條“成分一靶點(diǎn)一通路一疾病”的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)模式，其中主要涉及的信號(hào)通路包括TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)、癌癥的途徑、mTOR信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路及鈣信號(hào)通路等[9-11].

本研究初步揭示了鴉膽子治療卵巢癌的多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，預(yù)測(cè)得出的信號(hào)通路、生物學(xué)功能也與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合，說(shuō)明基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)及信號(hào)通路，對(duì)指導(dǎo)腫瘤的機(jī)制研究具有可行性.