林志鑾 金曉懷 張傳海 李寶銀 華偉平

摘要：以多花黃精為材料，采用超聲波輔助法提取粗多糖，研究超聲波處理時(shí)間、料液比、超聲波功率對(duì)多糖含量的影響，并對(duì)多花黃精多糖的羥基自由基清除能力和牛血清熒光淬滅能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，最佳的提取工藝為料液比為1 ∶20（g ∶mL），超聲時(shí)間為20 min，超聲功率為810 W;在此條件下，測(cè)得杉木林多花黃精多糖含量為 108.57 mg/g。采用吖啶紅比色法測(cè)得毛竹林多花黃精多糖對(duì)羥基自由基的清除率為97.72%;利用牛血清蛋白熒光淬滅效應(yīng)測(cè)得天然闊葉林多花黃精的多糖對(duì)BSA蛋白淬滅能力為85.38%。

關(guān)鍵詞：多花黃精;林下套種;多糖;牛血清;自由基;提取工藝;生物活性

中圖分類號(hào)： R284.2?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）20-0221-05

多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）為百合科（Liliaceae）黃精屬多年生草本植物，是百合科黃精屬中質(zhì)量最佳、藥效最好的藥材之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，多花黃精具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖、降血脂、防動(dòng)脈硬化、抗病毒、抗菌、提高機(jī)體免疫力等多種藥理作用[1]。其中，多糖含量是多花黃精根莖的有效藥用成分，也是衡量其藥材質(zhì)量的主要指標(biāo)之一[2]。

目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)多花黃精進(jìn)行了組培方面的研究工作。如黃云鵬等對(duì)在毛竹林、闊葉樹林、杉木林、馬尾松4種林分類型下套種的多花黃精的根莖多糖含量及生長(zhǎng)量進(jìn)行了分析[3];樊艷榮等研究了毛竹林下套種的多花黃精生長(zhǎng)情況[4-5];鄭林森分析了杉木林上層密度對(duì)多花黃精根莖產(chǎn)量的影響[6]。這些主要是考察多花黃精的多糖類成分檢測(cè)。

用超聲波輔助提取多花黃精多糖與生物活性的研究還未見報(bào)道，本研究采用正交法對(duì)多花黃精超聲波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并探討多糖提取物對(duì)羥基自由基的清除情況和牛血清的淬滅情況，為福建地區(qū)的多花黃精開發(fā)利用提供一定依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

原料：2017年10月于福建省邵武市朱山村（福建南武夷藥博園）中4種林（杉木林、天然闊葉林、毛竹林、人工闊葉林）林下采得多花黃精塊莖，經(jīng)武夷學(xué)院張傳海教授鑒定為多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua），百合科，黃精屬。取其塊莖，洗凈，烘干，粉碎，過60目篩。

試劑：D-無水葡萄糖對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-201205，含量99.5%），牛血清蛋白（上海展云化工有限公司，批號(hào)：1408207，分子量：67000），硫酸、苯酚、三氯乙酸、吖啶紅、羅丹明B、十二烷基苯磺酸鈉、七水合硫酸亞鐵、30%過氧化氫、三氨基甲烷、濃鹽酸、氯化鈉、正丁醇，以上試劑為分析純。水為二次蒸餾水（自制）。

儀器：電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9070A（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），超聲波清洗機(jī)S10H（致微（廈門）儀器有限公司），熒光分光光度計(jì)F-4500（日立公司），高速藥物粉碎機(jī)WK-400A（山東省青州市精誠(chéng)醫(yī)藥制造有限公司），循環(huán)真空泵SHB-Ⅱ（河南省鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），電子天平BS224SS（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?多花黃精多糖含量方法的建立

1.2.1.1?顯色反應(yīng)?準(zhǔn)確移取1.00 mL樣品溶液于具塞比色管中，加入1.00 mL 6%的苯酚，迅速加入5.00 mL 98%硫酸，靜置10 min，定容到25 mL，于80 ℃水浴中加熱30 min，即顯色完成[7]。用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)200～700 nm、發(fā)射波長(zhǎng) 200～700 nm下進(jìn)行3D同步掃描，儀器工作條件：電壓為 700 V;激發(fā)狹縫為5 nm;發(fā)射狹縫為5 nm;掃描速度為 1 200 nm/min。并采用熒光分光光度計(jì)自帶軟件flsol.exe進(jìn)行3D數(shù)據(jù)處理。

1.2.1.2?標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

吸取0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mL的2.00 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于7支25 mL比色管中。參考“1.2.1.1”節(jié)步驟顯色完畢后，在激發(fā)波長(zhǎng)λex=376 nm和發(fā)射波長(zhǎng)λem=390 nm下測(cè)定其熒光值A(chǔ)。以濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)、熒光值為縱坐標(biāo)作圖，并進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程。

1.2.1.3?多花黃精多糖含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取多花黃精粉末0.500 0 g，按照確定的優(yōu)化條件，進(jìn)行超聲提取;提取液經(jīng)過抽濾和減壓濃縮后，將濃縮液與三氯乙酸-正丁醇溶液 1 ∶1 混合，在-10 ℃下以12 000 r/min離心，除去蛋白，取下層清液10.00 mL于25 mL容量瓶中定容，按“1.2.1.1”節(jié)步驟顯色后，測(cè)定其熒光值A(chǔ)。然后根據(jù)“1.2.1.2”節(jié)的多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程，得到各樣品測(cè)試液的多糖濃度（mg/mL）;再按式（1）計(jì)算不同樣品的多糖含量。

式中：C為稀釋后樣品溶液多糖的濃度，mg/mL;N為稀釋倍數(shù);V為最初定容體積，mL;m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.1.4?單因素試驗(yàn)

以多花黃精提取液的多糖含量為指標(biāo)，分別對(duì)料液比（1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30，g ∶mL），超時(shí)功率（60%、70%、80%、90%、100%），超聲時(shí)間（10、15、20、25、30 min）等有關(guān)因素進(jìn)行考察和分析，確定適宜的水平，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.1.5?正交試驗(yàn)

本研究在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，進(jìn)一步考察了料液比（g ∶mL）、超聲功率（W）、超聲時(shí)間（min）等3個(gè)影響因素，以確定最優(yōu)提取工藝條件。因素與水平見表1。

1.2.2?多糖提取的方法學(xué)考察

1.2.2.1?驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取多花黃精粉末5份，每份 0.500 0 g，按照最佳提取工藝提取，顯色完成后立即測(cè)熒光值，計(jì)算多花黃精多糖平均提取率和含量。

1.2.2.2?精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取多花黃精粉末0.500 0 g，按照最佳提取工藝提取，顯色完成后立即連續(xù)6次測(cè)定溶液的測(cè)熒光值，計(jì)算其RSD值。

1.2.3.3?穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取多花黃精粉末0.500 0 g，按照最佳提取工藝提取，顯色完成后立即測(cè)吸光度，之后每隔1 h測(cè)1次熒光值，考察6 h內(nèi)多糖的穩(wěn)定性。

1.2.2.4?加樣回收試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取多花黃精粉末5份，每份0.500 0 g，按照最佳提取工藝提取，得到多花黃精待測(cè)液。取該待測(cè)液0.50 mL于具塞試管中，再加入2.00 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.50 mL，顯色完成后測(cè)其熒光值。計(jì)算多花黃精糖平均加樣回收率。

1.2.3?羥基自由基的清除作用

1.2.3.1?激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的確定

參照吖啶紅光度法[8]進(jìn)行測(cè)定，取2支10 mL具塞比色管，在1支中加入 2.40×10-5 mol/L吖啶紅溶液、9.60×10-5 mol/L羅丹明B溶液、5.00×10-2 mol/L DBS溶液、0.80 mol/L H2SO4溶液、8.00×10-4 mol/L FeSO4溶液各0.50 mL，在另1支多加 0.50 mL H2O2（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%），定容到10 mL，反應(yīng)30 min后，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，分別記為Aa、Ab，則自由基產(chǎn)生量可用ΔA=Aa-Ab表示。熒光工作參數(shù)測(cè)定與“1.2.1.1”節(jié)相同。

在該體系中，未加Fenton試劑及多糖體系的熒光值記為A1;未加多糖體系的熒光值記為A2;加入多糖提取液、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或者維生素C對(duì)照液1.00 mL后，測(cè)定體系的熒光值為A3。按公式（2）計(jì)算多糖對(duì)羥基自由基的清除率：

1.2.4?牛血清蛋白熒光淬滅效應(yīng)的測(cè)定

參照李麗萍等的方法[9-10]進(jìn)行。吸取0.50 mL濃度為2×10-5 mol/L的牛血清蛋白（BSA）溶液，1.00 mL pH值7.40 Tris-HCl緩沖液（含0.30 mol/L NaCl），各自加入1.00～10.00 mL的葡萄糖試液、多花黃精多糖試液，用純水定容至25.00 mL，25 ℃ 恒溫靜置5 min后，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，熒光工作參數(shù)的測(cè)定與“1.2.1.1”節(jié)相同。同時(shí)考察BSA蛋白淬滅方程關(guān)系，并計(jì)算牛血清蛋白的熒光淬滅率。按公式（3）計(jì)算多糖提取液對(duì)BSA蛋白淬滅率：

式中：A1′為加入多糖提取液熒光值，A2′為不加入多糖提取液熒光值。

2?結(jié)果與分析

2.1?熒光測(cè)定多糖含量的最大激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)確定

運(yùn)用熒光分光光度計(jì)分別對(duì)多糖、葡萄糖標(biāo)樣和空白試樣進(jìn)行3D掃描，以確定多花黃精多糖的最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，結(jié)果見圖1。確定本試驗(yàn)的檢測(cè)條件為激發(fā)波長(zhǎng)λex=376 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem=390 nm。

2.2?葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

依照“1.2.1.2”節(jié)所描述的步驟方法測(cè)定葡萄糖的熒光值，得到回歸方程y=19 206x+49.636，r=0.996 6。線性范圍：0～64 μg/mL。

2.3?單因素試驗(yàn)

2.3.1?提取功率對(duì)多糖提取率的影響

固定料液比 1 g ∶20 mL、提取時(shí)間25 min，選擇一定提取功率（540、630、720、810、900 W）進(jìn)行多花黃精多糖提取，平行測(cè)定3次，其多糖含量如圖3-A所示。在超聲波功率為810 W時(shí)候，多花黃精多糖的含量達(dá)到6.28 mg/g，而后下降，因此最適宜的超聲波功率為810 W。

2.3.2?提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響

固定超聲功率 810 W、料液比1 g ∶20 mL，選擇一定提取時(shí)間（10、15、20、25、30 min）進(jìn)行多花黃精多糖提取，平行測(cè)定3次，其多糖含量如圖3-B所示。在超聲波時(shí)間為25 min時(shí)候，多花黃精多糖的含量達(dá)到7.72 mg/g，而后下降，因此最適宜的超聲波時(shí)間為 25 min。

2.3.3?料液比多糖含量的影響

固定超聲功率810 W、超聲時(shí)間25 min，選擇不同的料液比（1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30，g ∶mL）進(jìn)行多花黃精多糖提取，平行測(cè)定3次，其多糖含量如圖3-C所示。在料液比為1 g ∶20 mL時(shí)候，多花黃精多糖的含量達(dá)到8.78 mg/g，而后下降，因此選擇料液比 1 g ∶20 mL 為佳。

2.4?正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，進(jìn)一步考察超聲時(shí)間、料液比、超聲功率對(duì)多糖含量的影響，以確定最佳的提取工藝條件。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，A、B、C 3種因素中，因素C極差值最大，因素A極差值最小，3種因素中對(duì)試驗(yàn)影響的主次順序依次是超聲時(shí)間>超聲功率>料液比。多糖最佳提取工藝組合是A2B2C1，即料液比為1 g ∶20 mL、超聲時(shí)間為 20 min、超聲功率為810 W，此時(shí)多花黃精的多糖提取率最高。

2.5?多花黃精多糖最佳提取工藝的方法學(xué)考察

驗(yàn)證試驗(yàn)：多花黃精多糖含量為93.06 mg/g（n=5）。

精密度試驗(yàn)：連續(xù)6次所測(cè)吸光度的RSD=1.97%（n=6），說明儀器精密度好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：多花黃精吸光度的RSD=1.74%（n=6），說明在6 h內(nèi)，多花黃精樣品溶液中的多糖采用本研究的顯色方法比較穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：多花黃精多糖的平均加樣回收率為 105.35%，RSD=1.33%（n=5）。

2.6?不同林分類型多花黃精多糖含量測(cè)定

按照“1.2.1.3”節(jié)試驗(yàn)步驟準(zhǔn)確稱取4種不同類型林分的多花黃精根莖粉末0.500 0 g，按照最佳提取工藝條件提取多花黃精多糖，并測(cè)定多糖的含量，結(jié)果見表3。

由表3可見，杉木林的多花黃精的多糖含量為 108.57 mg/g，明顯高于其他3組，而天然闊葉林、毛竹林、人工闊葉林3組之間差異不大。

2.7?多花黃精多糖對(duì)羥基自由基的清除能力

2.7.1?激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的確定

運(yùn)用熒光分光光度計(jì)分別對(duì)“1.2.3.1”節(jié)中的A1、A2、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或者維生素C對(duì)照液進(jìn)行3D掃描，以確定清除·OH的最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，結(jié)果見圖4。確定本試驗(yàn)的檢測(cè)條件為激發(fā)波長(zhǎng)λex=561 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem=575 nm。其中，A1的熒光強(qiáng)度為2 450.00，A2的熒光強(qiáng)度為703.30。

2.7.2?多花黃精多糖對(duì)·OH的清除率

按上述“1.2.3.1”節(jié)試驗(yàn)步驟，測(cè)定多花黃精多糖提取液對(duì)·OH的清除作用，并代入公式（2）計(jì)算其清除率，結(jié)果見表4。試驗(yàn)表明，對(duì)羥基自由基的清除能力表現(xiàn)為毛竹林>人工闊葉林>杉木林>天然闊葉林，其中，毛竹林下套種的多花黃精的多糖對(duì)·OH的清除率最高，達(dá)到97.72%。

2.7.3?多糖提取液、葡萄糖標(biāo)液、維生素C對(duì)照液對(duì)·OH清除作用比較

測(cè)試體系中分別加入0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、3.00 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、多花黃精多糖提取液、維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行體外羥基自由基清除能力檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著樣品加入量的增多，對(duì)于羥基自由基的清除率也在增大。當(dāng)多糖提取液加入量超過2.00 mL后，其羥基自由基清除能力超過97%。

2.8?牛血清蛋白的淬滅試驗(yàn)

2.8.1?激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的確定

通過熒光分光光度計(jì)分別對(duì)多糖、維生素C和空白試樣進(jìn)行3D掃描，確定多花黃精多糖與BSA相互作用的最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，結(jié)果如圖6。根據(jù)3D預(yù)掃描的結(jié)果和多次試驗(yàn)，最終確定測(cè)試條件為λex=282 nm，λem=353 nm。

2.8.2?多糖含量與BSA蛋白淬滅作用

試驗(yàn)體系中分別加入1.00～10.00 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、多花黃精多糖提取液，考察各自與BSA的相互作用，結(jié)果見圖7。代入公式（3）計(jì)算其淬滅率，結(jié)果見表5。

由圖7可知，隨著葡萄糖和多花黃精多糖提取液加入量的增加，由于與BSA之間產(chǎn)生了結(jié)合反應(yīng)，體系中的熒光強(qiáng)度都呈規(guī)律性遞減，對(duì)BSA起到了一定的熒光淬滅作用。葡萄糖與BSA相互作用的指數(shù)方程是y=-454.6ln（x）+1 085.3（r=0.997 6）;多花黃精多糖提取液與BSA結(jié)合作用的指數(shù)方程為y=-1 278ln（x）+3 359.7（r=0.999 1）。

由表5可知，對(duì)4種林分類型淬滅率進(jìn)行對(duì)比，表現(xiàn)為天然闊葉 林> 毛竹林>杉木林>人工闊葉林，天然闊葉林的多花黃精的多糖對(duì)BSA蛋白淬滅能力最強(qiáng)，達(dá)到85.38%。

3?結(jié)論與討論

本研究以多花黃精為研究對(duì)象，探討并優(yōu)化超聲波輔助提取多花黃精多糖的提取工藝，對(duì)多花黃精多糖的羥基自由基清除率和牛血清蛋白淬滅率進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，在料液比為1 g ∶20 mL、超聲時(shí)間為20 min、超聲功率為810 W的條件下，測(cè)得杉木林、天然闊葉林、毛竹林、人工闊葉林下套種多花黃精多糖含量為108.57、97.48、98.99、93.06 mg/g;采用吖啶紅比色法在最佳波長(zhǎng)λex=561 nm、λem=575 nm下，測(cè)得毛竹林、人工闊葉林、杉木林、天然闊葉林多花黃精多糖對(duì)羥基自由基的清除率為97.72%、92.23%、81.47%、76.15%;利用牛血清蛋白熒光淬滅效應(yīng)在最佳波長(zhǎng)λex=282 nm、λem=353 nm下，測(cè)得天然闊葉林、毛竹林、杉木林、人工闊葉林多花黃精的多糖對(duì)BSA蛋白淬滅能力為85.38%、84.84%、83.79%、79.46%。

杉木林多花黃精多糖含量最高，為108.57 mg/g;毛竹林多花黃精的多糖對(duì)·OH的清除率最高，為97.72%;天然闊葉林多花黃精的多糖對(duì)BSA蛋白淬滅能力最強(qiáng)，為85.38%。造成多花黃精多糖含量、自由基清除率、BSA蛋白淬滅率差異的機(jī)制可能還與栽培方式、施肥狀況、種植年限等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

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