高樹濤 李文彬 郭紹霞 李偉

摘要：為探索冬季大葉女貞枝條防御性酶活性的變化規(guī)律及其與植株抗寒性的關(guān)系，以不同抗寒等級(jí)植株枝條為材料，測定枝條水分含量、苯丙氨酸解氨酶活性、多酚氧化酶活性、抗壞血酸過氧化物酶活性、過氧化氫酶活性、相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量等各項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果表明：不同受凍等級(jí)的大葉女貞枝條苯丙氨酸解氨酶活性、多酚氧化酶活性、抗壞血酸過氧化物酶活性、過氧化氫酶活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量與植株抗寒性呈正相關(guān)，自由水與束縛水比值、丙二醛含量、相對電導(dǎo)率與植株抗寒性呈負(fù)相關(guān)。大葉女貞冬季枝條防御性酶活性以及可溶性蛋白含量、可溶性糖含量反映出的抗寒性與植株實(shí)際的受凍情況基本一致。不同受凍等級(jí)之間的抗寒性差異，是由于其在低溫脅迫下的生理活性調(diào)節(jié)能力不同所致，這種生理調(diào)節(jié)能力和植株的遺傳性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：大葉女貞;冬季低溫;生理響應(yīng);自由水;束縛水;苯丙氨酸解氨酶;多酚氧化酶;抗壞血酸過氧化物酶;過氧化氫酶;相對電導(dǎo)率;丙二醛;可溶性蛋白;可溶性糖

中圖分類號(hào)： S687.101?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）20-0168-04

近年來，由于全球氣候多變，極端天氣頻發(fā)，溫帶氣候區(qū)的木本植物在自然周年生長過程中經(jīng)常遭受環(huán)境低溫脅迫的威脅[1-2]，甚至出現(xiàn)因冷害導(dǎo)致植物死亡的現(xiàn)象[3]。低溫傷害每年都給全世界農(nóng)林生產(chǎn)造成巨大損失。研究表明，植物受低溫冷害時(shí)，體內(nèi)的細(xì)胞膜透性、滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)及代謝過程等一系列生理過程都會(huì)發(fā)生顯著的變化[4-5]。5種酢漿草屬植物經(jīng)過自然低溫處理，結(jié)合形態(tài)特征觀測，測定相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、可溶性蛋白含量等指標(biāo)，評(píng)價(jià)其抗寒性，結(jié)果表明在自然低溫處理下，5種植物的生理生化指標(biāo)變化趨勢基本一致，與自然低溫處理下的觀測結(jié)果[6]一致。王娜等研究八角金盤、夾竹桃、闊葉十大功勞、樟葉槭4種常綠植物的抗寒性表明，在低溫下植物體的可溶性糖含量、游離脯氨酸含量、過氧化物酶活性和相對電導(dǎo)率整體呈上升趨勢[7]。也有研究表明，低溫可以誘導(dǎo)黃瓜幼苗葉片中苯丙氨酸解氨酶的基因表達(dá)。葉片中相對電解質(zhì)滲漏率和丙二醛含量顯著升高，提高了胞內(nèi)抗氧化酶（過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶）活性，可有效地清除活性氧分子，維持抗氧化物質(zhì)抗壞血酸（AsA）氧化還原狀態(tài)，緩解低溫引起的光損傷和氧化損傷[8]。

大葉女貞（Ligustrun lucidum）別稱蠟樹，又名女貞、高桿女貞、冬青等，為木樨科女貞屬常綠闊葉喬木，原產(chǎn)亞熱帶地區(qū)[4]。中國栽培以長江以南及西南地區(qū)為主，甘肅南部與華北南部少有栽培;其葉片光潔亮綠，經(jīng)冬不落，是南方園林綠化中的主要樹種之一。隨著中國北方城市園林綠化的發(fā)展，大葉女貞已引種到北京、上海、青島等地。然而我國絕大部分北方地區(qū)冬季寒冷，大葉女貞常表現(xiàn)較嚴(yán)重的凍害，影響其觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。選育出適合北方發(fā)展優(yōu)良抗寒品種，安全越冬已成為推廣大葉女貞在北方地區(qū)生產(chǎn)栽培發(fā)展中的重要制約因素。

本試驗(yàn)通過對青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)栽植的大葉女貞冬季受凍情況進(jìn)行全面調(diào)查并分級(jí)，初選出部分優(yōu)良抗寒單株。而表型選擇通常會(huì)受到環(huán)境因子的影響，為確定初選的耐寒植株、正常植株及受凍嚴(yán)重的植株之間在生理水平上是否有差異，筆者通過不同抗寒性植株枝條水分含量以及防御性酶活性的變化，進(jìn)一步在生理水平上對篩選出的耐寒植株進(jìn)行評(píng)定，以期為培育大葉女貞優(yōu)良抗寒品系提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

供試大葉女貞枝條采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校園。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)位于120°12′E、36°20′N，屬暖溫帶季風(fēng)大陸性氣候，年均氣溫12.6 ℃，1月最低，月平均氣溫-2 ℃，8月最高，月平均氣溫25.7 ℃，年平均降水量700 mm左右。

1.2?試驗(yàn)方法

大葉女貞受凍調(diào)查等級(jí)試驗(yàn)于2018年3月1日至4月14日在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)菌根生物技術(shù)研究所進(jìn)行。調(diào)查方法為實(shí)地普查記錄受凍害植物的受害程度以及具體表現(xiàn)，同時(shí)為了便于比較分析，本研究在參考相關(guān)研究資料[9-11]的基礎(chǔ)上，以綜合所調(diào)查植物總體受凍害狀況的特點(diǎn)為依據(jù)，制定了凍害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，具體見表1。

隨機(jī)選擇不同受害等級(jí)的植株3株，隨機(jī)剪取1年生發(fā)育枝10根，并迅速在剪切口封蠟，裝入塑封袋封好。帶回實(shí)驗(yàn)室后，迅速用刀分離1年生枝條的韌皮部與木質(zhì)部。把韌皮部分8份，分裝后，放入-20 ℃的低溫冰箱內(nèi)備用。

1.3?測定指標(biāo)

1.3.1?大葉女貞枝條總含水量測定?取任一稱量瓶并稱質(zhì)量（m1）;取相同大小的枝條3根，立即裝入稱量瓶中，蓋緊瓶蓋并精確稱質(zhì)量（m2）;再將稱量瓶連同枝條放入烘箱中105 ℃ 殺青，其間敞開瓶蓋，于85 ℃下烘至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量（m3）。質(zhì)量差等于葉片含水量，以上測定重復(fù)3次，總含水量計(jì)算公式如下：

植物組織的總含水量=（m2-m3）/（m2-m1）×100%。

1.3.2?大葉女貞枝條自由水含量的測定?任取一稱量瓶并稱質(zhì)量（m4），取相同大小的枝條3根，立即裝入稱量瓶中，蓋緊瓶蓋并稱質(zhì)量（m5），再在稱量瓶中加入5 mL蔗糖（濃度為C1），再分別稱質(zhì)量（m6）。把稱量瓶放置于暗處6 h，其間不時(shí)輕輕搖動(dòng)，到預(yù)定的時(shí)間后充分搖動(dòng)溶液，分別測定各瓶蔗糖的濃度（C2），以上測定重復(fù)3次，具體計(jì)算公式如下：

植物組織中自由水的含量=（m6-m5）×（C1-C2）/[（m5-m4）×C2]×100%;

束縛水=總含水量-自由水含量。

1.3.3?防御性酶活性的測定?苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的測定參照紫外分光光度計(jì)法[12];抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定參照Xia等的方法[13];過氧化氫酶（CAT）活性的測定采用紫外線吸收法;可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法;相對電導(dǎo)率測定采用電導(dǎo)率法;丙二醛（MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸比色法;多酚氧化酶（PPO）活性、可溶性糖含量參考王學(xué)奎的方法[14]測定。

1.4?數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和繪圖，采用DPSv 7.5分析軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan's法進(jìn)行多重比較。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同單株大葉女貞葉片冬季自由水和束縛水含量

自由水與束縛水的含量與抗寒性緊密相關(guān)。自由水直接參與細(xì)胞各種代謝活動(dòng)，當(dāng)自由水含量升高時(shí)，代謝的活性升高，生長發(fā)育較快;當(dāng)束縛水的含量升高時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的原生質(zhì)變成凝膠狀態(tài)，植物的代謝活性減弱，生長緩慢。自由水與束縛水的比值可以用來評(píng)價(jià)植株的抗寒性。由表2可見，在同一低溫脅迫下，6個(gè)大葉女貞受凍等級(jí)枝條中自由水與束縛水比值差異明顯，0級(jí)大葉女貞自由水與束縛水比值最小，為1.42，Ⅴ級(jí)比值最大，為3.85。植物抗寒性與自由水與束縛水比值呈負(fù)相關(guān)，大葉女貞不同枝條抗寒性的順序?yàn)?級(jí)>Ⅰ級(jí)>Ⅱ級(jí)>Ⅲ級(jí)>Ⅳ級(jí)>Ⅴ級(jí)。

2.2?不同單株大葉女貞葉片冬季PAL和PPO活性

苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是苯丙烷類次生代謝途徑的限速酶和關(guān)鍵酶，與植物的非生物逆境抗性密切相關(guān)。在同一低溫脅迫下，6個(gè)大葉女貞受凍等級(jí)枝條中PAL活性差異顯著。Ⅱ級(jí)大葉女貞PAL 活性最高?為20.4 U/mg?Ⅴ級(jí)活性最低?為7.6 U/mg。

植物抗寒性與PAL活性呈正相關(guān)，大葉女貞不同枝條抗寒性的順序?yàn)棰蚣?jí)>0級(jí)>Ⅰ級(jí)>Ⅲ級(jí)>Ⅳ級(jí)>Ⅴ級(jí)（圖1）。

多酚氧化酶（PPO）廣泛存在于植物體的各種器官或組織中，是植物抗寒性的基礎(chǔ)條件之一。在同一低溫脅迫下，6個(gè)大葉女貞受凍等級(jí)枝條中PPO活性差異顯著。0級(jí)大葉女貞枝條PPO活性最高，為170 U/g，Ⅴ級(jí)活性最低，為 86.3 U/g，植物抗寒性與PPO活性呈正相關(guān)，抗寒性的順序?yàn)?級(jí)>Ⅰ級(jí)>Ⅲ級(jí)>Ⅱ級(jí)>Ⅳ級(jí)>Ⅴ級(jí)（圖1）。

2.3?不同單株大葉女貞葉片冬季APX和CAT活性

植物通過調(diào)節(jié)自身一系列的代謝反應(yīng)對低溫脅迫作出適應(yīng)性響應(yīng)，維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性和胞內(nèi)滲透平衡，其中APX能夠積累抗氧化物質(zhì)抗壞血酸（AsA）含量，保護(hù)細(xì)胞免受傷害。在同一低溫脅迫下，6個(gè)大葉女貞受凍等級(jí)枝條中APX活性差異顯著。Ⅰ級(jí)大葉女貞APX活性最高，為216 U/g，Ⅴ級(jí)活性最低，為135.4 U/g。植物抗寒性與APX活性呈正相關(guān)，抗寒性的順序?yàn)棰窦?jí)>Ⅱ級(jí)>Ⅲ級(jí)>零級(jí)>Ⅳ級(jí)>Ⅴ級(jí)（圖2）。

同時(shí)，植物離體后還會(huì)產(chǎn)生較多的抗氧化酶及其他非酶類抗氧化劑來提高適應(yīng)性，以抵御活性氧氧化損傷及致死效應(yīng)。其中，CAT可以將過氧化氫分解成水，可清除體內(nèi)具有潛在危害的 O-2·和H2O2，這樣可避免羥自由基對細(xì)胞的破壞。在同一低溫脅迫下，6個(gè)大葉女貞受凍等級(jí)枝條中CAT活性差異顯著。0級(jí)大葉女貞CAT活性最高，為5.4 U/g，Ⅴ級(jí)活性最低，為2.2 U/g。植物抗寒性與CAT活性呈正相關(guān)，抗寒性的順序?yàn)?級(jí)>Ⅰ級(jí)>Ⅲ級(jí)>Ⅱ級(jí)>Ⅳ級(jí)>Ⅴ級(jí)（圖2）。

2.4?不同單株大葉女貞葉片冬季可溶性蛋白和可溶性糖含量

在低溫條件下可溶性蛋白含量提高是植物對低溫的適應(yīng)性反應(yīng)?？扇苄缘鞍讓ξ唇?jīng)抗寒鍛煉的原生質(zhì)膜有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是增加了質(zhì)膜中蛋白質(zhì)之間的親和力，從而增強(qiáng)了膜結(jié)構(gòu)在冰融過程中的穩(wěn)定性。在同一低溫脅迫下，6個(gè)大葉女貞受凍等級(jí)枝條中可溶性蛋白含量差異顯著。0級(jí)大葉女貞可溶性蛋白含量最高，為7.4 mg/g，Ⅴ級(jí)含量最低，為3.7 mg/g?？购耘c可溶性蛋白含量呈正相關(guān)，抗寒性的順序?yàn)?級(jí)>Ⅰ級(jí)>Ⅱ級(jí)>Ⅳ級(jí)>Ⅲ級(jí)>Ⅴ級(jí)（圖3）。

在低溫條件下植物體內(nèi)的可溶性糖不斷積累，其主要是作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和防脫水劑起作用，可以降低細(xì)胞的水勢并增強(qiáng)其持水力。在同一低溫脅迫下，6個(gè)大葉女貞受凍等級(jí)枝條中可溶性糖含量差異顯著。Ⅱ級(jí)大葉女貞可溶性糖含量最高，為0.86 mg/g，Ⅴ級(jí)含量最低，為0.34 mg/g。植物抗寒性與可溶性糖含量呈正相關(guān)，抗寒性的順序?yàn)棰蚣?jí)> 0級(jí)>Ⅰ級(jí)>Ⅲ級(jí)>Ⅳ級(jí)>Ⅴ級(jí)（圖3）。

2.5?不同單株大葉女貞葉片冬季MDA含量和相對電導(dǎo)率

膜脂過氧化加劇所導(dǎo)致的細(xì)胞膜透性增加和細(xì)胞滲透壓變化，是導(dǎo)致植株耐寒性強(qiáng)弱的依據(jù);而MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，細(xì)胞滲透壓變化影響植物相對電導(dǎo)率，MDA含量直接反映膜脂過氧化損傷程度。在同一低溫脅迫下，6個(gè)大葉女貞受凍等級(jí)枝條中MDA含量和相對電導(dǎo)率差異顯著。Ⅰ級(jí)大葉女貞MDA含量和相對電導(dǎo)率最低，分別為 4.5 mg/g 和43%，Ⅴ級(jí)活性最高，分別為10.4 mg/g和73%。植物抗寒性與MDA含量呈負(fù)相關(guān)，抗寒性的順序?yàn)棰窦?jí)<0級(jí)<Ⅱ級(jí)<Ⅲ級(jí)<Ⅳ級(jí)<Ⅴ級(jí);與相對電導(dǎo)率也呈負(fù)相關(guān)，抗寒性順序?yàn)棰窦?jí)<0級(jí)<Ⅲ級(jí)<Ⅱ級(jí)<Ⅳ級(jí)<Ⅴ級(jí)（圖4）。

2.6?各單項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)系數(shù)矩陣

本研究對6個(gè)大葉女貞受凍等級(jí)處理及9個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，得到相關(guān)系數(shù)矩陣（表3）。由表3可以看出，大葉女貞枝條PAL活性與PPO活性呈顯著正相關(guān)，與可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)。大葉女貞枝條自由水和束縛水比值與PAL活性、PPO活性、APX活性、CAT活性、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量呈負(fù)相關(guān)，與MDA含量、相對電導(dǎo)率呈正相關(guān)。

3?結(jié)論與討論

植物的生長發(fā)育以及對不良環(huán)境脅迫的響應(yīng)是一個(gè)多因素控制的復(fù)雜過程。許多研究證實(shí)，當(dāng)植株受到低溫環(huán)境影響后，植物體內(nèi)自由水和束縛水含量、CAT活性、MDA含量、相對電導(dǎo)率、APX活性、PAL活性、PPO活性、可溶性蛋白含量，可溶性糖含量往往會(huì)發(fā)生較大幅度的變化，這表明均與植物的抗寒性有密切關(guān)系[15-16]。

植物體內(nèi)的水分含量及狀態(tài)在一定程度上決定植物的抗寒性[17]，自由水含量高、束縛水含量低的植物抗寒性差。自由水在低溫狀態(tài)下易結(jié)冰，導(dǎo)致細(xì)胞脫水死亡或者在細(xì)胞內(nèi)部形成冰晶損傷細(xì)胞膜系統(tǒng)，造成植物抗寒性下降;而束縛水通常在-20～-25 ℃下保持不結(jié)冰。本研究結(jié)果表明，受害情況較輕的0級(jí)和Ⅰ級(jí)枝條總含水量和束縛水含量較高，自由水含量較低，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐寒性。植物葉片細(xì)胞膜的穩(wěn)定性與其抗寒性密切相關(guān)。當(dāng)植物受到凍害時(shí)，體內(nèi)活性氧含量會(huì)增多，膜脂過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的MDA會(huì)增多，同時(shí)葉片細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)受到不同程度的破壞，膜透性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)的部分電解質(zhì)外滲，引起代謝紊亂，植物的生長發(fā)育受到阻礙，甚至死亡。研究細(xì)胞膜透性、MDA含量與抗寒性的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜的穩(wěn)定性與抗寒性呈正相關(guān)，MDA含量與抗寒性呈負(fù)相關(guān)，證明細(xì)胞膜透性和MDA含量是衡量植物抗寒性的有效指標(biāo)[5]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，受害情況較輕的0級(jí)和Ⅰ級(jí)枝條內(nèi)MDA含量以及細(xì)胞膜透性較小，凍害程度較大的Ⅴ級(jí)枝條中MDA含量、細(xì)胞膜透性最大，表明外觀凍害程度較大的大葉女貞枝條與生理上的反應(yīng)基本一致，這與林艷等的研究結(jié)果[18]相符合。

同時(shí)，植物受低溫后還會(huì)產(chǎn)生較多的抗氧化酶（PAL、PPO、APX、CAT等）及其他非酶類抗氧化劑來提高適應(yīng)性，以抵御活性氧氧化損傷及致死效應(yīng)[19-20]?？寡趸割惪梢詫⑦^氧化氫分解成水，相互之間共同作用可清除體內(nèi)具有潛在危害的 O-2·和H2O2，這樣可避免羥自由基對細(xì)胞的破壞。本試驗(yàn)中受害情況較輕的0級(jí)和Ⅰ級(jí)枝條PAL活性、PPO活性、APX活性以及CAT活性等較高，具有較強(qiáng)的耐寒性，表明抗氧化酶類可以在一定程度上表現(xiàn)出大葉女貞的抗寒性，酶活性越強(qiáng)，植株抗寒性越強(qiáng)。植物遭受低溫后，所伴隨的生理生化變化包括蛋白質(zhì)、糖等大分子營養(yǎng)物質(zhì)和結(jié)構(gòu)物質(zhì)逐漸降解[21-23]。其中，可溶性蛋白、可溶性糖含量是表現(xiàn)植物抗寒性的重要指標(biāo)，本研究結(jié)果表明0級(jí)大葉女貞枝條可溶性蛋白含量最高，Ⅱ級(jí)可溶性糖含量次之，這可能是由環(huán)境因素引起的，其具體原因還須進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，大葉女貞不同個(gè)體植株表現(xiàn)出的不同抗寒性的差異，在其枝條自由水與束縛水含量、防御性酶活性及可溶性蛋白和可溶性糖含量的變化上呈現(xiàn)出不同的變化趨勢，與其在外觀表型上變化基本一致。

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