崔華威 陶飛 苗愛敏

摘要：種子發(fā)芽率是種子檢驗(yàn)中的一個(gè)重要指標(biāo)，無損、快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行發(fā)芽率測定具有重要意義。綜述了種子發(fā)芽率無損檢測方法的研究進(jìn)展，重點(diǎn)介紹了這些方法的原理、優(yōu)點(diǎn)及在實(shí)際檢測當(dāng)中的應(yīng)用效果，預(yù)測了發(fā)芽率無損檢測發(fā)展方向，以期為相關(guān)工作提供科學(xué)依據(jù)和參考。

關(guān)鍵詞：種子發(fā)芽率;無損檢測;研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)： S330.2?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）20-0009-04

種子發(fā)芽率是種子檢驗(yàn)中的重要指標(biāo)，發(fā)芽率的高低與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和種子經(jīng)營有著密切的關(guān)系，在確定播種量以及種子生理研究方面具有重要的作用[1]。目前，測定種子發(fā)芽率的主要方法有直接測定法和間接測定法，其中直接測定法是通過標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)來測定種子發(fā)芽率，而間接測定法則是通過測定種子物理、化學(xué)、生理特性等指標(biāo)來間接估測發(fā)芽率[2]。

直接測定法根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)或相關(guān)規(guī)程規(guī)定的條件，在人工氣候箱中進(jìn)行試驗(yàn)，過程大多需要1～2周時(shí)間，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，在種子質(zhì)量檢驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。但是，該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不能迅速取得結(jié)果，特別是對(duì)于休眠期長的種子[1]。另外，在大批量的種子采收、購銷和調(diào)運(yùn)中，往往因時(shí)間緊、任務(wù)重而來不及進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。因此，選用間接測定法快速測定發(fā)芽率具有重要意義。

本文介紹種子發(fā)芽率間接測定方法，重點(diǎn)綜述其中的無損檢測方法，包括無損檢測的原理、優(yōu)點(diǎn)以及實(shí)際應(yīng)用效果，并預(yù)測發(fā)芽率無損檢測發(fā)展方向，以期為相關(guān)工作提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1?種子發(fā)芽率快速測定方法

傳統(tǒng)的種子發(fā)芽率快速測定方法有染色法、電導(dǎo)率法、吸脹狀態(tài)法、酶學(xué)方法等。其中，氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法和酶學(xué)方法簡便準(zhǔn)確，應(yīng)用廣泛[1]。

染色法為使用TTC、刃天青和紅墨水等對(duì)種子進(jìn)行染色，觀察不同活力種子染色效果的差異，探尋其與種子發(fā)芽率之間關(guān)聯(lián)[3-4]。電導(dǎo)率法基于不同裂變程度稻種膜結(jié)構(gòu)完整性不同造成的電解質(zhì)滲透差異，間接獲取種子內(nèi)部生化信息，然后對(duì)發(fā)芽率進(jìn)行預(yù)測[5]。

種子在發(fā)芽吸脹初期的細(xì)胞膜重建和損傷修復(fù)能力影響電解質(zhì)和可溶性物質(zhì)外滲的程度，高活力種子細(xì)胞膜重建和損傷修復(fù)能力強(qiáng)，種子浸泡液的電導(dǎo)率低，電導(dǎo)率與發(fā)芽率呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，種子浸出液電導(dǎo)率測定曾被成功地應(yīng)用于多種作物的種子發(fā)芽率測定[6-7]。

吸脹狀態(tài)法根據(jù)種子吸水后形態(tài)變化來判定種子活力及發(fā)芽率。有活力的種子浸入水中時(shí)，開始吸水比較緩慢，隨后會(huì)趨于平衡;沒活力的種子由于蛋白質(zhì)變性，原生質(zhì)體的透性提高，浸入水中后種子呈典型的水腫狀態(tài)。據(jù)此可根據(jù)種子吸脹后的狀態(tài)來判斷種子發(fā)芽率的高低。史兆慶采用吸脹狀態(tài)法成功測定了香椿種子發(fā)芽率[8]。但該方法適用于自身比較干燥的種子，易受溫度、種子質(zhì)量、水質(zhì)等因素影響，誤差較大。

在種子儲(chǔ)藏過程中，隨著種子活力的降低，與呼吸有關(guān)的酶類（如過氧化氫酶、過氧化物酶以及谷氨酸脫羧酶等）活性降低。國內(nèi)外大量研究表明，過氧化氫酶活性與種子發(fā)芽率具有極顯著的相關(guān)性，可以通過過氧化氫酶活性大小預(yù)測種子發(fā)芽率[1，9]。

上述發(fā)芽率間接測定方法雖然具有一定的適用性和準(zhǔn)確性，但是會(huì)對(duì)種子造成破壞和損傷，檢測過的種子發(fā)芽能力喪失，或貯藏性能明顯降低。近年來，隨著科技的不斷發(fā)展，種子科學(xué)家們紛紛致力于研究無損的發(fā)芽率檢驗(yàn)新技術(shù)，以期在不破壞種子結(jié)構(gòu)及特性的前提下，更加準(zhǔn)確、簡便、快捷地評(píng)價(jià)種子質(zhì)量和種用價(jià)值。

2?種子發(fā)芽率無損檢測技術(shù)

種子發(fā)芽率無損檢測方法是指在不破壞種子結(jié)構(gòu)或特性的前提下，實(shí)現(xiàn)種子發(fā)芽率快速測定的方法，主要包括光譜技術(shù)、高光譜成像、質(zhì)譜技術(shù)、軟X射線造影、電子鼻、熱成像、分色法、激光散斑技術(shù)和超微弱發(fā)光等。無損檢測技術(shù)與傳統(tǒng)測定方法的關(guān)系見表1。

2.1?光譜技術(shù)

光譜學(xué)主要研究各種物質(zhì)光譜的產(chǎn)生及其同物質(zhì)之間的相互作用。光譜學(xué)技術(shù)（spectroscopy）主要包括近紅外（NIR）、

中紅外（MIR）、熒光（fluorescence）、傅里葉變換紅外（FT-IR）光譜技術(shù)以及拉曼光譜（Raman spectra）、偏振光譜（polarization spectra）技術(shù)[10]，在種子發(fā)芽率檢測中常用的方法是近紅外、偏振光譜技術(shù)。

近紅外光譜（NIRS）技術(shù)利用近紅外光照射樣品，依據(jù)某1種或多種化學(xué)成分在特定譜區(qū)的吸收特性來快速檢測其在樣品中的含量，具有方便、快速、高效、準(zhǔn)確、成本較低、不破壞樣品、不消耗化學(xué)試劑、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)前使用NIRS技術(shù)來分析作物種子質(zhì)量主要集中在水稻、玉米、燕麥、結(jié)縷草等作物上[11-14]。

李毅念等提出一種基于近紅外光譜技術(shù)的快速、無損測試雜交水稻種子發(fā)芽率的新方法，發(fā)芽率預(yù)測值與真實(shí)值之間的相對(duì)誤差在4.2%以內(nèi)[15]。另外2個(gè)針對(duì)稻種糙米的獨(dú)立研究也表明，可以建立基于近紅外特征光譜的糙米發(fā)芽率預(yù)測模型，模型在稻種糙米發(fā)芽率預(yù)測方面有較好的能力[11，16]。此外，研究顯示，結(jié)縷草種子的近紅外光譜值與標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽率之間存在回歸關(guān)系，二者之間的相關(guān)系數(shù)達(dá)到 0.987[14]?？梢姡瑢⒔t外光譜技術(shù)應(yīng)用于種子發(fā)芽率檢驗(yàn)是可行的。

除了近紅外光譜技術(shù)外，還有學(xué)者利用偏振光譜技術(shù)預(yù)測稻種發(fā)芽率。偏振光譜技術(shù)是基于強(qiáng)度、偏振度及偏振角信息，對(duì)目標(biāo)成分進(jìn)行非接觸檢測的新技術(shù)。程宇瓊等提出基于連續(xù)偏振光譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)稻種發(fā)芽率快速、無損檢測的方法[5]，利用獲取的連續(xù)偏振光譜構(gòu)建稻種發(fā)芽率預(yù)測模型，結(jié)果顯示，模型預(yù)測精度較高（相關(guān)系數(shù)為0.976，相對(duì)誤差為 0.85%），利用連續(xù)偏振光譜技術(shù)也能實(shí)現(xiàn)稻種發(fā)芽率的無損、快速檢測。

2.2?高光譜成像

高光譜成像（hyperspectral imaging）是包含大量窄波段影像的成像技術(shù)，結(jié)合了傳統(tǒng)的成像和光譜學(xué)技術(shù)，能夠同時(shí)獲得檢測對(duì)象的空間和光譜信息，在種子品種識(shí)別、種子成分檢測、病蟲害檢測等方面具有很大的應(yīng)用潛力[17]。

李美凌等利用高光譜圖像技術(shù)對(duì)水稻種子活力進(jìn)行檢測研究，將老化48 h與未老化的稻種進(jìn)行對(duì)比分析，得出高光譜技術(shù)可以用于鑒定稻種活力的結(jié)論[18]。于施淼等將南粳46水稻作為研究對(duì)象，利用高光譜成像技術(shù)預(yù)測稻種發(fā)芽率，根據(jù)稻種不同區(qū)域特征波長的光譜數(shù)據(jù)建立預(yù)測模型并加以比較，結(jié)果表明，利用高光譜成像技術(shù)檢測糙米發(fā)芽率是可行的[2]。

董高利用高光譜成像技術(shù)進(jìn)行單籽粒小麥發(fā)芽預(yù)測，分析了單粒發(fā)芽與未發(fā)芽小麥籽粒之間的光譜差異，建立發(fā)芽與未發(fā)芽籽粒預(yù)測模型，二者的平均正確識(shí)別率能達(dá)到 72.5%[17]。Matzrafi等利用高光譜成像技術(shù)對(duì)長芒莧（Amaranthus palmeri）種子進(jìn)行研究，發(fā)芽種子和不發(fā)芽種子的區(qū)分準(zhǔn)確度分別為81.9%和76.4%[19]。表明利用高光譜成像技術(shù)進(jìn)行單粒籽粒發(fā)芽預(yù)測存在一定可行性。

2.3?質(zhì)譜方法

質(zhì)譜法（mass spectrometry）是一種與光譜并列的譜學(xué)方法，通過電場和磁場將物體內(nèi)運(yùn)動(dòng)的離子按質(zhì)荷比分離并進(jìn)行檢測的方法。

表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜（DAPCI-MS）是常使用的種子發(fā)芽率無損檢測方法，可在常溫、常壓和未經(jīng)樣品預(yù)處理的前提下對(duì)樣品表面進(jìn)行直接分析，具有無損、快速、能分析復(fù)雜樣品等優(yōu)點(diǎn)。羅麗萍等采用DAPCI-MS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，實(shí)現(xiàn)了新鮮和陳年蓮子的快速鑒別[20]。殷勤等對(duì)小粒咖啡種子進(jìn)行人工老化處理，得到發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)明顯不同的7份種子樣品，采用DAPCI-MS獲得咖啡種子表面的化學(xué)指紋圖譜和質(zhì)譜信息特征，結(jié)果表明，DAPCI-MS技術(shù)能有效區(qū)分7份咖啡種子[21]。

姜翠翠等利用DAPCI-MS技術(shù)測定蘿卜種子中的芥子堿含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老化程度越高，蘿卜種子中芥子堿的含量越大，蘿卜種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢相應(yīng)的降低，認(rèn)為芥子堿可以作為種子質(zhì)量標(biāo)記物，該方法無需樣品預(yù)處理，檢測速度快，可作為新型的種子發(fā)芽率無損檢測方法[22]。

此外，質(zhì)譜法可以和色譜技術(shù)聯(lián)用，結(jié)合質(zhì)譜的高靈敏度、強(qiáng)鑒別能力和色譜的高分辨率，例如目前較成熟的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜組分的分離與鑒定。李海燕等將6種觀賞辣椒親本及其組配的3種F1代種子作試驗(yàn)材料，采用GC-MS技術(shù)對(duì)辣椒種子中的脂肪酸成分進(jìn)行分析及鑒定，發(fā)現(xiàn)種子發(fā)芽率與棕櫚酸含量、硬脂酸含量存在極顯著負(fù)相關(guān)性，在辣椒生產(chǎn)栽培中可以通過檢測脂肪酸含量快速測定種子發(fā)芽率[23]。

2.4?軟X射線造影

軟X射線造影（soft X-ray imaging）是利用長波X射線的一種透視攝影，具有射線能級(jí)弱、成像清晰、分辯力高等特點(diǎn)。隨著X射線機(jī)的發(fā)展和造影技術(shù)的進(jìn)步，這一技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛，如醫(yī)學(xué)中對(duì)軟組織腫瘤的診斷、輕薄金屬及非金屬的探傷以及文物考古等。20世紀(jì)60年代以來，種子科技領(lǐng)域開始引進(jìn)并應(yīng)用這一技術(shù)[24]。

軟X射線造影早期主要被用于查定空粒和蟲害粒種子[25]，之后開始被用于種子發(fā)芽率檢測研究。顧德發(fā)通過小麥種子軟X射線膠片判讀出的發(fā)芽率與實(shí)際發(fā)芽率之間無顯著差異[24]。鄭郁善等使用軟X射線儀對(duì)殼斗科14個(gè)樹種的536份種子進(jìn)行研究，結(jié)果表明，各樹種種子的X光膠片判讀值與實(shí)際發(fā)芽率之間沒有顯著差異[26]。此外，針對(duì)甜椒種子、小桐子種子和油松種子的研究也表明，可以根據(jù)X射線圖像判讀值來預(yù)測種子的發(fā)芽率[25，27-28]。

2.5?電子鼻

電子鼻（electronic nose）技術(shù)是利用氣體傳感器陣列識(shí)別氣味的電子系統(tǒng)，它可以實(shí)時(shí)、連續(xù)地監(jiān)測特定部位的氣味狀況。與普通化學(xué)分析儀器不同，通過該技術(shù)得到的不是被測樣品中某種或某幾種成分的定性與定量結(jié)果，而是樣品中揮發(fā)成分的整體信息，也稱“指紋”數(shù)據(jù)[29]。

Jonsson等提出將電子鼻技術(shù)用于谷物品質(zhì)檢測的方法，通過對(duì)微生物活動(dòng)時(shí)釋放出的氣味進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)了對(duì)谷物品質(zhì)的預(yù)測[30]。程紹明等利用電子鼻技術(shù)對(duì)發(fā)芽率分別為90%、80%、70%、60%、50%和0的6個(gè)番茄種子樣品進(jìn)行分析，結(jié)果表明，電子鼻技術(shù)可以很好地區(qū)分出番茄種子發(fā)芽率為90%、80%、50%～70%和不發(fā)芽4種情況;當(dāng)種子發(fā)芽率為70%、60%、50%時(shí)，其圖形信息部分重疊，利用電子鼻技術(shù)較難將其區(qū)分開[31]，表明該技術(shù)目前在種子發(fā)芽率預(yù)測方面還處于起步階段，準(zhǔn)確度還有待提高。

2.6?熱成像

熱成像（thermal imaging）又稱紅外熱成像（簡稱TIS），是指利用紅外探測器和光學(xué)成像物鏡獲得物體表面紅外熱像圖的技術(shù)，圖像上不同顏色代表被測物體的不同溫度。TIS可以清晰、準(zhǔn)確、直觀地提取物體表面溫度幅度與分布的微小變化，觀察到人眼無法觀測到的物體外形輪廓或表面熱分布[32]。

研究表明，種子萌發(fā)過程中產(chǎn)生的代謝熱可以描述種子的新陳代謝水平，而新陳代謝水平的高低正是反映種子活力高低的重要指標(biāo)[33]。因此，種子溫度的變化必然與種子的活力有著密切的聯(lián)系，對(duì)種子溫度信息的捕捉可以用來推測種子的活力水平。Kranner等首先提出將紅外熱成像技術(shù)應(yīng)用于種子活力檢測，用紅外熱成像儀捕捉5種老化程度不同的豌豆種子在吸水萌發(fā)過程中的溫度變化，證實(shí)了紅外熱成像技術(shù)在種子活力檢測中的可行性[33]。

Fang等基于稻種老化時(shí)間不同時(shí)的物理學(xué)和生理學(xué)差異，提出一種基于紅外熱成像技術(shù)無損檢測稻種發(fā)芽率的方法，建立了稻種發(fā)芽率的紅外熱模型，結(jié)果表明，所建模型在稻種發(fā)芽率無損檢測方面有較高的精度（相關(guān)系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.900 3和4.101 2）[34]，證實(shí)采用紅外熱成像技術(shù)檢測稻種發(fā)芽率是可行的。

2.7?其他技術(shù)

由于無損、快速測定種子發(fā)芽率的現(xiàn)實(shí)需要，除了上述技術(shù)外，研究人員紛紛致力于對(duì)其他技術(shù)的開發(fā)，目前已報(bào)道的有分色法、激光散斑技術(shù)（laser speckle）和超微弱發(fā)光（ultraweak luminescence）等。

分色法根據(jù)種皮顏色預(yù)測種子發(fā)芽率。吳國平等根據(jù)比色卡將三葉芹種子按顏色分組，再將分組種子的百分比數(shù)分別與相應(yīng)顏色的發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)相乘之后求和，結(jié)果作為待測定三葉芹種子發(fā)芽率的預(yù)測值，經(jīng)過和標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，分色法預(yù)測出的發(fā)芽率與實(shí)際發(fā)芽率之間無顯著差異，可用作種子質(zhì)量檢驗(yàn)[35]。

激光散斑是指當(dāng)激光照射在相對(duì)粗糙物體表面上時(shí)形成的隨機(jī)干涉圖樣，散斑特征可以反映種子內(nèi)部粒子的活躍程度，指示種子的活力大小。李黔渝等通過激光散斑成像技術(shù)，利用栓皮櫟種子內(nèi)部散射粒子的動(dòng)態(tài)變化與激光散斑變化的對(duì)應(yīng)關(guān)系，通過圖像處理技術(shù)分辨種子內(nèi)部粒子的活躍程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其與種子發(fā)芽情況及種子活力具有較高的一致性，認(rèn)為可以利用激光散斑技術(shù)對(duì)種子發(fā)芽情況進(jìn)行快速測定[36]。

超微弱發(fā)光是一種低水平的生物發(fā)光，反映了生物體細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的新陳代謝、功能調(diào)解和信息交換，是生物體生長代謝的動(dòng)態(tài)指標(biāo)[37]。研究表明，經(jīng)過電磁輻射處理的大豆生活力比未處理的種子大大增強(qiáng)，而同時(shí)其超微弱發(fā)光值也顯著增加;而當(dāng)采用代謝抑制劑處理綠豆種子后，種子活性大大降低，其超微弱發(fā)光值也同時(shí)降低[38]。王春芳等對(duì)貯藏 0～24 個(gè)月的稻谷和小麥種子進(jìn)行了超弱發(fā)光分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，貯藏期間稻谷的超弱發(fā)光值與其發(fā)芽率之間呈良好的非線性關(guān)系，而小麥的超弱發(fā)光值與其發(fā)芽率之間呈良好的線性關(guān)系，所獲模型可以很好地通過稻谷和小麥的超弱發(fā)光值來預(yù)測其發(fā)芽率[39]。

3?結(jié)論與展望

光譜學(xué)、高光譜成像和質(zhì)譜法通過檢測某種化學(xué)成分的光譜和質(zhì)譜信息，間接計(jì)算出該化學(xué)成分在種子中的含量，進(jìn)而探討該成分與發(fā)芽率之間的相關(guān)性。軟X射線法通過射線的穿透性，呈現(xiàn)種子內(nèi)部完整結(jié)構(gòu)，通過內(nèi)部結(jié)構(gòu)分析，尋找其與發(fā)芽率之間的關(guān)系。

電子鼻和熱成像技術(shù)分別檢測種子的揮發(fā)氣味和表面熱分布，探討其與種子發(fā)芽率之間的關(guān)聯(lián)。分色法、激光散斑技術(shù)和超微弱發(fā)光方法分別嘗試從種子顏色、散斑特征和生物發(fā)光角度，建立檢測結(jié)果與發(fā)芽率之間的關(guān)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)芽率的間接測定。

綜上可知，上述發(fā)芽率無損檢測方法通過分析種子的物理（光譜、質(zhì)譜、熱成像、X光圖像、種皮顏色及散斑）和化學(xué)（揮發(fā)氣味）特征，探討這些特征與發(fā)芽率之間的相關(guān)性，因此都是間接測定法。

由于種子發(fā)芽是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，牽涉到諸多內(nèi)部生理變化，而上述方法均從單一角度和指標(biāo)進(jìn)行發(fā)芽率檢測，結(jié)果的精確性和準(zhǔn)確性很難保證。因此歸納發(fā)芽率無損檢測目前存在的問題。（1）間接性。以上發(fā)芽率無損檢測方法通過分析種子的物理、化學(xué)特征，探討該特征與發(fā)芽率之間的相關(guān)性，間接得出該特征與發(fā)芽率之間的相關(guān)關(guān)系。間接性帶來了無損、快速等優(yōu)點(diǎn)，但準(zhǔn)確性卻難以保證。（2）單一性。上述方法針對(duì)單一理化特征進(jìn)行測定，而這一特征與發(fā)芽率之間只是存在一定相關(guān)性，造成結(jié)果的預(yù)測成分大于實(shí)際成分，因此，這些方法更準(zhǔn)確地講是發(fā)芽率預(yù)測方法而不是檢測方法。（3）波動(dòng)性。以上方法大多選定一個(gè)作物品種作試驗(yàn)材料，沒有考慮該方法對(duì)不同品種、不同收獲條件和貯藏時(shí)間種子進(jìn)行檢測時(shí)結(jié)果的波動(dòng)性，方法的適用性、穩(wěn)定性與可靠性還有待進(jìn)一步研究。

基于以上分析認(rèn)為，種子發(fā)芽率無損檢測今后可以從以下方面開展。

（1）加強(qiáng)理論研究。重點(diǎn)研究種子萌發(fā)過程中內(nèi)部生理生化指標(biāo)變化，明確種子發(fā)芽率與種子活力及生活力的內(nèi)在區(qū)別，基于有發(fā)芽能力和無發(fā)芽能力種子的生理差異，研發(fā)更具針對(duì)性的種子發(fā)芽率無損檢測技術(shù)。（2）綜合使用現(xiàn)有無損檢測方法。針對(duì)具體作物篩選出2～3種有效方法同時(shí)使用，方法之間相互印證或彌補(bǔ)不足，使用多個(gè)測定結(jié)果綜合預(yù)測具體發(fā)芽率數(shù)值，提高預(yù)測準(zhǔn)確度。（3）加大樣本種類和數(shù)量。加強(qiáng)數(shù)據(jù)收集，針對(duì)大量品種，盡可能多地收集不同收獲條件、不同貯藏狀況種子樣本，建立更具普適性的發(fā)芽率無損檢測技術(shù)，從總體上明確該技術(shù)的適用范圍及準(zhǔn)確度。

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