單折 崔東潔 代西梅

摘要：以常規(guī)小麥品種偃展4110為試驗材料，通過水培試驗，研究生理指標(biāo)的變化與植物抗逆性之間的關(guān)系。設(shè)置6個氮素濃度水培處理，在不同濃度的氮（尿素）脅迫下，對苗期小麥根部進行了生理生化測定，并對其根尖形態(tài)進行了激光共聚焦掃描顯微觀察。結(jié)果表明，脯氨酸通過改變自身累積量在植物適應(yīng)逆境中發(fā)揮了滲透保護劑的作用;可溶性糖含量則由于高氮脅迫出現(xiàn)了下降的趨勢;在適當(dāng)濃度的氮素脅迫下，根系活力強于高氮和低氮處理;鏡檢結(jié)果顯示，尿素脅迫使小麥根尖細(xì)胞產(chǎn)生了不同程度的損傷，這些都可能與植物抗逆性存在某種相關(guān)性，為逆境植物的進一步研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：小麥;氮脅迫;生理指標(biāo);顯微觀察;根部形態(tài)

中圖分類號： S512.1+20.1?文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0108-04

水、肥作為農(nóng)作物整個生長周期中最重要的2個影響因素，對于農(nóng)作物增產(chǎn)和保持高產(chǎn)發(fā)揮了重要作用。在北方大部分地區(qū)，農(nóng)作物生長過程中獲取土壤水分的主要來源是降水，因而肥料的合理施用成為農(nóng)作物能否獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵[1]。禾本科作物（如小麥、水稻、玉米等）對氮的需求量大，對磷、鉀需求量小，因此，合理施用氮肥（尿素）成為作物正常生長、順利達到預(yù)期產(chǎn)量的重中之重。肥料的施用一般分2步進行[2]，即播種前深施基肥和生長期撒施追肥?？筛鶕?jù)作物具體的生長狀況在不同的生長階段適量追肥，這樣有助于作物順利完成營養(yǎng)生長和生殖生長。在作物大面積種植的過程中常常會出現(xiàn)施肥不足或施肥過量的情況，施肥不足會導(dǎo)致作物生長緩慢、葉片發(fā)黃、植株矮小、籽粒灌漿不足呈干癟狀，最終嚴(yán)重減產(chǎn);而施肥過量則會造成作物貪青晚熟，也不利于作物生長。在氮肥施用過量的情況下作物葉片瘋狂生長，植株間的透風(fēng)性差，易發(fā)生病蟲害，且組織柔軟韌性差，易倒伏，這些都會影響最終的考種測產(chǎn)。從環(huán)境角度上來看，過度施用尿素會使土壤堿化，某些化肥還會在土壤中殘留一些污染物，嚴(yán)重破壞了生態(tài)環(huán)境，進一步加劇了國內(nèi)土地資源緊張的局面，在某種程度上是一種資源浪費，同時增加了農(nóng)民的種植成本。而氮肥不足則會使作物出現(xiàn)嚴(yán)重的營養(yǎng)不良。因此，適量適時施用化肥才會在投入最少的情況下獲得最高的產(chǎn)量回報。

此外，相關(guān)研究表明，在高氮或低氮條件下，植物細(xì)胞內(nèi)部某些內(nèi)含物（如脯氨酸、甜菜堿、各種糖類）的含量發(fā)生明顯的變化[3]，這些內(nèi)含物對于細(xì)胞進行正常的新陳代謝，維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓具有重要作用。這些變化在植物根部表現(xiàn)得更為明顯，因此，對于農(nóng)作物來說可根據(jù)其根部內(nèi)含物含量的變化對施肥水平進行一些調(diào)整，使作物能在條件最優(yōu)的土壤環(huán)境下完成整個生長周期。通過進一步顯微觀察，初步認(rèn)識不同氮素處理下小麥根尖所產(chǎn)生的細(xì)胞學(xué)變化，以期為今后的生產(chǎn)實踐提供一定的參考。

1.1?材料

試驗所用小麥為常規(guī)品種偃展4110。2017年8月挑取籽粒飽滿的小麥種子消毒，25 ℃浸泡過夜，在紙床上進行發(fā)芽培養(yǎng)[4]。先在黑暗的條件下25 ℃催芽1～2 d，后轉(zhuǎn)至溫度為25 ℃、光—暗周期為12h—12h的光照培養(yǎng)室培養(yǎng)5 d，去胚乳后進行水培。水培選用正常MS培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，根據(jù)試驗需要添加不同劑量的尿素[5]。試驗設(shè)置6個濃度梯度[6]：1號（氮素缺乏的MS培養(yǎng)液）、2號（MS培養(yǎng)液）、3號（氮素濃度為1 mmol/L的MS培養(yǎng)液）、4號（氮素濃度為10 mmol/L 的MS培養(yǎng)液）、5號（氮素濃度為20 mmol/L的MS培養(yǎng)液）、6號（氮素濃度為40 mmol/L的MS培養(yǎng)液）。其中，氮素來自尿素中所含的氮元素，2號為水培的正常氮素濃度。每2 d更換1次培養(yǎng)液，分別在水培的5 d和10 d后取材進行試驗[7]。試驗在鄭州大學(xué)離子束生物工程實驗室內(nèi)進行。

1.2?提取組織液及各物質(zhì)含量測定

1.2.1?脯氨酸含量的測定

根據(jù)曹建康等的《果蔬采后生理生化實驗指導(dǎo)》中的方法[8]測定脯氨酸含量。

1.2.2?可溶性糖含量的測定

采用蒽酮試劑法[8]測定小麥根部可溶性糖含量。

1.3?根系活力測定

采用α-萘胺氧化法[9]對小麥的根系活力分別進行定性觀察和定量測定。

1.4?根尖的熒光染色及顯微觀察

1.4.1?取樣及固定?用解剖刀切取在不同尿素濃度條件下培養(yǎng)的麥苗根尖約5 mm，將其放入含有4%多聚甲醛的PEMS中固定，之后用PEMS緩沖液漂洗3～5次。

1.4.2?酶解?將“1.4.1”節(jié)處理后的根尖用含有質(zhì)量濃度 1.5 g/L 溶壁酶、5.0 g/L果膠酶和10.0 g/L纖維素酶的PEMS酶解液在37 ℃條件下進行酶解，可適當(dāng)在酶解液中加入甘露醇，有利于保持酶解過程中細(xì)胞內(nèi)外的滲透勢，便于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架維持原狀。酶解結(jié)束后用PEMS緩沖液漂洗 3～5 次。

1.4.3?染色及制片?將“1.4.2”節(jié)處理后的根尖用含有1% Triton X-100的PEMS緩沖液處理1～2 h，同樣經(jīng)PEMS緩沖液清洗后，用熒光染料進行熒光染色，染色結(jié)束后用PEMS緩沖液進行漂洗，直至細(xì)胞外殘余的熒光染料被洗凈為止，采用抗熒光猝滅劑進行封片后，在激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）下進行顯微觀察[10-11]。

2?結(jié)果與分析

2.1?小麥外部生長狀況

通過觀察，小麥去胚乳轉(zhuǎn)入水培后在外部形態(tài)上顯現(xiàn)出明顯差異，圖1為小麥水培1周后的生長狀況。由圖1可知，在不同氮素濃度下小麥植株高度和根部長度產(chǎn)生了明顯變化，隨著尿素濃度的增加，小麥的葉片數(shù)量減少，甚至在高氮條件的6號處理下部分葉片枯萎變黃，生長停滯不前，從后期試驗中發(fā)現(xiàn)，隨著水培時間的延長，6號中的爛根現(xiàn)象愈來愈明顯;1號中的小麥與前期相比雖然在植株高度和根部長度上沒有明顯差異，但葉片顏色發(fā)黃，葉片呈細(xì)長型，其韌性不如正常植株，部分葉片出現(xiàn)從中間折斷的現(xiàn)象。

2.2?脯氨酸含量的變化

通過試驗測定，根據(jù)不同濃度氮素培養(yǎng)下小麥根部組織提取液的吸光度（D520 nm），并結(jié)合脯氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入公式計算得出各組相應(yīng)的脯氨酸含量。由圖2可知，隨著施氮量的增加，脯氨酸含量總體呈現(xiàn)先增后減的趨勢。這與朱虹等在逆境條件下脯氨酸對于植物生長影響的研究結(jié)果[12]相一致，即在一定范圍內(nèi)氮素濃度高于或低于正常值會使植物體內(nèi)脯氨酸產(chǎn)生積累。

2.3?可溶性糖含量的變化

通過測定不同氮素濃度處理后苗期小麥根部可溶性糖的吸光度（D630 nm），根據(jù)可溶性糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線及公式計算得出不同氮素濃度處理下小麥根部可溶性糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，苗期小麥根部可溶性糖含量的變化在水培5 d和10 d后有所不同，水培5 d后可溶性糖含量隨著氮素濃度的升高呈先增加后降低的趨勢，這與左文博等的研究結(jié)果[13]在一定程度上是相一致的。而水培10 d后，可溶性糖含量則出現(xiàn)先減后增再減的現(xiàn)象，這與郭相平等的研究結(jié)果[14]有一定差異，造成這種差異的原因可能是植物的可溶性糖對氮脅迫不如水分脅迫那么敏感。

2.4?根系活力的差異

對不同氮素濃度處理下苗期小麥根系活力進行定性觀察，最終著色結(jié)果（圖4）顯示，缺氮（1號）和高氮（5號、6號）條件下的根組織著色較淺，這表明其根系活力弱于其他幾組。試驗測定不同氮素濃度脅迫下苗期小麥根系活力的吸光值（D510 nm），并根據(jù)α-萘胺含量標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)的α-萘胺濃度（圖5）。6個處理的α-萘胺濃度關(guān)系為3號>2號>1號、4號>5號、6號，這表明適當(dāng)?shù)牡孛{迫可引起根系活力的[CM（25]增加。試驗過程中α-萘胺自動氧化的數(shù)值是一定的，因此根據(jù)α-萘胺含量標(biāo)準(zhǔn)曲線所得到的α-萘胺濃度可作為根系活力定量測定的一個指標(biāo)。

2.5?根尖熒光染色鏡檢結(jié)果

通過熒光染色鏡檢發(fā)現(xiàn)，苗期小麥的根部細(xì)胞在低氮或正常情況下能夠保持完整的形態(tài)（圖6-1），根冠部分呈橢圓的帽狀，且薄壁細(xì)胞不規(guī)則地排列在一起，將分生區(qū)細(xì)胞包裹在內(nèi)部。在氮素脅迫下，根尖細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度的受損現(xiàn)象。圖6-2中根尖頂端處的帽狀結(jié)構(gòu)已經(jīng)完全脫落，根冠中的薄壁細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的結(jié)構(gòu)變化;圖6-3中根尖外圍本應(yīng)該包裹分生區(qū)細(xì)胞的薄壁細(xì)胞呈松散狀，并有部分薄壁細(xì)胞脫離了根冠，帽狀結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞;圖6-4中明顯可以觀察到根冠部分的熒光強度弱于分生區(qū)，且伴隨有薄壁細(xì)胞脫離根尖的現(xiàn)象。經(jīng)多次試驗驗證，圖6-4中的現(xiàn)象大多出現(xiàn)在高氮脅迫（5號、6號）下的根尖細(xì)胞中;中氮條件（3號、4號）下出現(xiàn)圖6-2、圖6-3、圖6-4中現(xiàn)象的頻率低于高氮，而低氮（1號）或正常條件（2號）下出現(xiàn)這3種現(xiàn)象的頻率又低于中氮，或者不出現(xiàn)。這表明氮素脅迫下，根冠薄壁細(xì)胞的結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞，猜測這種破壞會影響根冠薄壁細(xì)胞對內(nèi)部分生區(qū)細(xì)胞的保護功能。

3?結(jié)論和展望

對于禾本科作物來說，氮、磷、鉀肥中最為重要的是氮肥，而尿素是主要的氮素來源，因此，作物能否順利完成整個生長周期的關(guān)鍵在于是否合理施用尿素。在大田種植的區(qū)域內(nèi)，往往可以觀察到這樣一種現(xiàn)象，同一品種的小麥生長狀態(tài)很難達到齊性，這主要是由后期大田調(diào)控模式上的不同造成的[15]。冬小麥在播種后到出苗期這段時間主要靠胚乳供養(yǎng)，因此這段時期的生長狀態(tài)基本恒定，緊接著是小麥的越冬期，由于冬季氣溫較低，麥苗幾乎處于休眠狀態(tài)，生長緩慢或停滯不前，因此其生長不會有明顯的差別，之后在土壤基肥的肥力作用下，小麥越冬后直至返青期這段時期在生長狀態(tài)上也不會表現(xiàn)出很大差異[16]。一般來講，有經(jīng)驗的耕作者會在小麥拔節(jié)期到來之前進行追肥，在這個時期進行追肥一方面可以彌補土壤經(jīng)歷漫長冬季后的肥力不足，另一方面可為小麥孕穗期的到來積攢充足的肥料[17]，冬小麥的籽粒飽滿與否取決于灌漿期的水肥條件，有研究表明，中水中肥的條件才能使小麥達到最高的產(chǎn)量指標(biāo)[18]。

試驗在6種不同濃度的氮素培養(yǎng)條件下，對苗期小麥的一些生理指標(biāo)進行了測定，并對不同水平處理的材料進行了差異性比較[19]，在進一步的顯微觀察中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞水平的不同。本研究結(jié)果表明，在一定濃度的氮素脅迫下，苗期小麥通過調(diào)整自身脯氨酸的累積量來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的滲透勢，從而平衡機體的滲透壓，因此，脯氨酸起到滲透保護劑的的作用[20]，此外，在氮素濃度高出一定范圍之后，脯氨酸含量呈現(xiàn)下降趨勢并最終趨于平緩。對于不同的逆境脅迫，植物可能會有不同的抗逆途徑，試驗中，水培5 d后小麥根部的可溶性糖含量隨著氮素濃度的升高呈先增加后減少的趨勢，而1號、3號和4號水培10 d后小麥根部的可溶性糖含量明顯高于2號，并隨著氮素濃度的繼續(xù)增加可溶性糖的含量明顯下降。雖然引發(fā)這種現(xiàn)象的機制還不是很明了，但從另外一些研究結(jié)果中猜測，可能是由于可溶性糖在高氮脅迫下不敏感，也可能是由于高氮條件破壞了可溶性糖合成的某些前體物質(zhì)，導(dǎo)致可溶性糖含量的降低。根系活力定性觀察和定量觀察的結(jié)果表明，在適當(dāng)高氮條件下的根系活力強于低氮和超高氮，這說明適度的氮素濃度能誘發(fā)植物根系產(chǎn)生更多的過氧化氫酶或活性氧促使α-萘胺氧化，從而使大量的紅色沉淀附著于根表面。在鏡檢過程中，氮素脅迫下的視野中更容易看到圖6-2、圖6-3以及圖6-4中所顯示的根冠受損的現(xiàn)象，這表明高濃度的氮素對于根冠的薄壁細(xì)胞有一定的破壞作用，氮素在滲透進入薄壁細(xì)胞的過程中，一方面可能破壞了細(xì)胞與細(xì)胞之間的胞間連絲結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致整個帽狀結(jié)構(gòu)脫落，或部分細(xì)胞從根冠帽狀結(jié)構(gòu)上分離形成單個細(xì)胞，另一方面氮素的進入可能增大了薄壁細(xì)胞細(xì)胞膜的分子篩直徑，在熒光染色的過程中大部分熒光染料進入細(xì)胞之后又在隨后的漂洗過程中被洗脫掉，因而最終的鏡檢結(jié)果顯示，根冠細(xì)胞熒光強度不高。

自然界中存在各種各樣的逆境，在非生物脅迫下，植物自身會產(chǎn)生一系列的變化來適應(yīng)這種逆境。同一植物對抗某種逆境會有不止一條抗逆途徑，當(dāng)然，不同的植物對抗同一逆境條件的途徑也會有所不同，這就使得抗逆境植物的研究更加復(fù)雜，目前已經(jīng)有多種分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于植物抗逆性的研究，隨著顯微技術(shù)的發(fā)展，可通過顯微觀察為植物抗逆的分子機制提供更為直觀的依據(jù)。

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