鮑榮靜 梁棟 梁慧敏

摘要：以翦股穎品種高地的吸漲種子、胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)和胚根生長(zhǎng)點(diǎn)為主進(jìn)行不同外植體高頻植株再生的研究，結(jié)果表明，不論是愈傷組織的誘導(dǎo)還是胚性愈傷組織的形成以及叢生芽的分化，均以胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)為最高，其次是吸漲種子，胚根生長(zhǎng)點(diǎn)最低;高濃度的2，4-D有利于愈傷組織的誘導(dǎo);但適時(shí)調(diào)整激素配比及繼代時(shí)間對(duì)形成胚性愈傷組織及叢生芽的分化更關(guān)鍵有效。試驗(yàn)分析得出高頻胚性愈傷組織形成的激素配比為2.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，高頻叢生芽分化的激素配比為2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。

關(guān)鍵詞：翦股穎;外植體;愈傷組織誘導(dǎo);胚性愈傷組織形成;叢生芽分化

中圖分類號(hào)： S688.404.+3?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）20-0091-04

翦股穎（Agrostis stolonifera）是一種多年生冷季型草坪草，耐低修剪、匍匐生長(zhǎng)力強(qiáng)、葉片細(xì)密成坪速度快，易形成觀賞性高的草坪，在世界各地被廣泛種植，也是我國北方地區(qū)高檔草坪及高爾夫果嶺等運(yùn)動(dòng)場(chǎng)建植的常用草種[1]。我國目前所用的多種翦股穎草種均由國外引進(jìn)，由于生長(zhǎng)環(huán)境差異大，這些草種在我國很多地區(qū)表現(xiàn)不盡如人意，尤其是在華東及其以南高溫高濕的地區(qū)常常表現(xiàn)耐熱性、抗病蟲害能力弱、耐磨性低等，使得草坪質(zhì)量在使用過程中很快變差，養(yǎng)護(hù)管理成本加大，易出現(xiàn)斑禿、綠期縮短等問題。因此，利用現(xiàn)代細(xì)胞生物工程技術(shù)進(jìn)行翦股穎品種改良將是一條快捷有效的途徑。而建立翦股穎合適的外植體高頻組培再生體系是進(jìn)行品種遺傳改良的重要前提。

本研究以翦股穎品種高地為主，選其3種外植體，以在MS基本培養(yǎng)基中添加不同濃度激素的配方設(shè)計(jì)為處理，并進(jìn)行相應(yīng)培養(yǎng)條件的調(diào)控，誘導(dǎo)3種外植體形成愈傷組織和胚性愈傷組織，進(jìn)而分化出叢生芽及完成種苗壯苗生根培養(yǎng)等過程，摸索出翦股穎高頻組培再生植株合適的外植體、適宜的激素配比或配方、不同生長(zhǎng)發(fā)育階段合適的培養(yǎng)條件等，為翦股穎進(jìn)一步的品種改良打下基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

供試的翦股穎品種為高地（Highland），種子由北京克勞沃草業(yè)中心提供。

1.2?方法

1.2.1?試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)?試驗(yàn)從2016年3月至2018年3月在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)園藝學(xué)院組培實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.2?材料消毒與處理?將上述翦股穎成熟種子先用洗滌劑浸泡10 min，再用流水沖洗5～10 min，之后用2% NaClO溶液攪拌消毒10 min，放入75%乙醇浸泡40 s，取出用0.1% HgCl2攪拌消毒5～8 min，用滅菌水沖洗6～8遍，然后再放入滅菌溫水（35～40 ℃）浸泡，直至種子吸漲種皮變軟后，用無菌濾紙吸干水分，即可用于接種。

1.2.3不同外植體的獲得與初始培養(yǎng)?通過下述方法可獲得3種外植體用于初始培養(yǎng)。吸漲種子（A）：取一部分種皮變軟的吸漲種子直接接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上;帶生長(zhǎng)點(diǎn)胚芽（B）：將吸漲種子先接種到只含瓊脂的空白培養(yǎng)基上，待種子長(zhǎng)出胚芽后，切取0.5～1.5 cm大小的具有生長(zhǎng)點(diǎn)的胚芽作為外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上;帶生長(zhǎng)點(diǎn)胚根（C）：將吸漲種子先接種到只含瓊脂的空白培養(yǎng)基上，待種子長(zhǎng)出胚根后，切取0.5～1.0 cm大小的帶有生長(zhǎng)點(diǎn)的胚根作為外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.4?愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代胚性愈傷組織形成的培養(yǎng)?接種外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，其中又添加了不同生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素等激素調(diào)配成不同濃度組成的配方;每個(gè)培養(yǎng)瓶接種10個(gè)外植體，每個(gè)配方接種30瓶，放置在（25±3） ℃培養(yǎng)架上暗培養(yǎng)25～30 d后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率;中間繼代1次，即50～60 d后，統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織的形成率。

1.2.5?叢生芽的分化培養(yǎng)?將繼代培養(yǎng)50～60 d的愈傷組織，轉(zhuǎn)接到設(shè)計(jì)好的添加不同濃度激素的以 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基的分化培養(yǎng)基上，每個(gè)處理每瓶接種6個(gè)愈傷組織，每個(gè)配方接種20瓶，進(jìn)行分化培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：白天22～25 ℃，夜晚18～20 ℃，光照時(shí)間16 h/d，光照度1 500～2 000 lx;50～60 d后，統(tǒng)計(jì)叢生芽分化率。

1.2.6?壯苗生根培養(yǎng)?將分化的叢生芽轉(zhuǎn)接到設(shè)計(jì)好的添加不同濃度生長(zhǎng)素的以MS培養(yǎng)基或1/2 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基的生根培養(yǎng)基上，每個(gè)處理每瓶接種6個(gè)叢生芽，每個(gè)配方接種20瓶，同樣放置在白天22～25 ℃，夜晚18～20 ℃，光照時(shí)間16 h/d，光照度2 000～2 500 lx，進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)，20～25 d后，觀察再生植株的生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)根的誘導(dǎo)率。

1.3?數(shù)據(jù)處理與指標(biāo)計(jì)算公式

采用Excel 2007進(jìn)行計(jì)算與制表，各項(xiàng)指標(biāo)的計(jì)算公式如下：

愈傷組織誘導(dǎo)率=形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%;

胚性愈傷組織形成率=胚性愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織數(shù)×100%;

叢生芽分化率=形成叢生芽的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織數(shù)×100%;

生根率=生根的叢生芽數(shù)/接種的叢生芽數(shù)×100%。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同激素配比對(duì)不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)及胚性愈傷組織形成的影響

2.1.1?不同激素濃度配方對(duì)不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響?在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，通過加入不同濃度的2，4-D、6-BA和NAA，設(shè)置6個(gè)配方處理，處理時(shí)間為30 d，研究其對(duì)翦股穎的不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)的影響。從表1可以看出，3種外植體經(jīng)過6個(gè)配方處理30 d后，均能誘導(dǎo)出愈傷組織，證明誘導(dǎo)愈傷組織的成敗關(guān)鍵主要不是試驗(yàn)材料，而是培養(yǎng)條件，尤其是激素成分配比很重要[2];但出愈率高低快慢是和取材的外植體部位有關(guān)系的。本試驗(yàn)結(jié)果表明，3種外植體在同一配方條件下出愈率差異顯著（P<0.05），其中以胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)為最高，6個(gè)配方處理均高于吸漲種子和胚根生長(zhǎng)點(diǎn);其次是吸漲種子，胚根生長(zhǎng)點(diǎn)最低，說明胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞在離體狀態(tài)下對(duì)培養(yǎng)條件特別是激素很敏感，可快速進(jìn)入脫分化狀態(tài)，成為迅速增殖的愈傷組織。試驗(yàn)所設(shè)置的6個(gè)配方之間出愈率差異也較大，總體趨勢(shì)：隨著2，4-D質(zhì)量濃度的升高，出愈率增加，當(dāng)2，4-D質(zhì)量濃度為3.0 mg/L（配方4）時(shí)，3種外植體出愈率均高于其他配方，達(dá)到最大;隨著2，4-D質(zhì)量濃度的降低，3種外植體出愈率均下降，綜合順序表現(xiàn)為配方4>配方6>配方3>配方5>配方2>配方1;其中配方1中無2，4-D，但添加較高濃度的NAA，說明生長(zhǎng)素對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)起關(guān)鍵作用，但2，4-D對(duì)提高出愈率更有利[3]。

2.1.2?不同激素濃度配方處理對(duì)不同外植體胚性愈傷組織形成的影響?3種外植體在6個(gè)配方處理下生長(zhǎng)58～60 d（中間繼代1次）后，統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織形成率。由表2可見，胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)經(jīng)過6個(gè)配方60 d左右處理后，除配方1外其他5個(gè)配方胚性愈傷組織形成率明顯高于吸漲種子和胚根生長(zhǎng)點(diǎn);吸漲種子稍差，胚根生長(zhǎng)點(diǎn)最差;說明胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)不論是作為愈傷組織誘導(dǎo)還是胚性愈傷組織形成都是最好的外植體。從6個(gè)配方處理來看：配方1處理胚性愈傷組織形成率很低甚至沒有，說明2，4-D是翦股穎外植體形成胚性愈傷組織的關(guān)鍵因子;配方處理6胚性愈傷組織形成率最高，其他配方依次下降，順序?yàn)榕浞?>配方4>配方2>配方3。

結(jié)合表1與表2結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6個(gè)配方處理愈傷組織誘導(dǎo)率和胚性愈傷組織形成率并不一致，愈傷組織誘導(dǎo)率受 2，4-D 濃度的影響較大，而胚性愈傷組織形成率主要是培養(yǎng)基中不同種類激素之間的相互作用的綜合表現(xiàn)[2]。

2.1.3?繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胚性愈傷組織形成的影響?脫分化的細(xì)胞在形態(tài)發(fā)生上具有較大的可塑性[2]，3種外植體培養(yǎng)28～30 d繼代1次，接種到新鮮的原培養(yǎng)基培養(yǎng)50～60 d時(shí)，所有成熟細(xì)胞逐漸脫分化轉(zhuǎn)變?yōu)橛筛鞣N類型的細(xì)胞組成的愈傷組織，隨著繼代次數(shù)的增加及培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，3種外植體不管是放在哪個(gè)配方下愈傷組織的分化能力都是逐漸下降甚至消失的（圖1、圖2、圖3和圖4）;同時(shí)觀察到，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間繼代的愈傷組織易產(chǎn)生毛狀物，褐變率也有明顯的上升。

導(dǎo)致愈傷組織分化能力下降的原因主要是愈傷組織的類型有差異，主要分為3類：第1類生長(zhǎng)迅速，初期愈傷組織乳白色，但后期易發(fā)褐并產(chǎn)生纖細(xì)根毛，這種愈傷較難分化出芽;第2類愈傷組織生長(zhǎng)較快，呈淡乳黃色，黏性較大，觸碰能明顯感覺到緊實(shí)的瘤狀結(jié)構(gòu)，這種愈傷大部分為胚性愈傷，易萌出叢生芽;第3類愈傷組織呈水漬狀易褐化，這種愈傷也較難分化。3種外植體均可形成這3類愈傷組織但差異明顯，其中胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)易形成第2類胚性愈傷組織; 吸漲種子以第2類居多，第1類較少;胚根生長(zhǎng)點(diǎn)主要是第1類。在6個(gè)配方之間這3類愈傷組織也存在明顯差異，其中配方1以第3類愈傷為主;配方2、配方3、配方4以第1類愈傷居多，第2類愈傷較少;配方5和配方6主要產(chǎn)生第2類愈傷。

2.2?不同激素濃度配方對(duì)不同外植體叢生芽分化率的影響

由表3可見，胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)的6個(gè)配方叢生芽分化率均明顯高于吸漲種子，吸漲種子又均明顯高于胚根生長(zhǎng)點(diǎn)，說明最好的外植體是胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)。6個(gè)配方叢生芽分化率也有差異，排序?yàn)榕浞?>配方4>配方6>配方3>配方2>配方1，可以看出最好的配方配比是配方5，最差的是配方1。

2.3?基本培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)減半及IBA濃度不同對(duì)生根的影響

從表4可以看出，基本培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分是否減半對(duì)翦股穎叢生芽的生根率沒有明顯影響，所以在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，若需大量生產(chǎn)組培苗，為節(jié)約成本可以使用低濃度的無機(jī)鹽培養(yǎng)基即1/2MS。試驗(yàn)結(jié)果也表明培養(yǎng)基中添加不同濃度IBA對(duì)生根率影響不明顯，但若無IBA，則對(duì)生根率有明顯的影響。

3?討論

翦股穎組培外植體一般采用的是成熟種子，目前還未見有以翦股穎吸漲種子、胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)及胚根生長(zhǎng)點(diǎn)作為外植體，系統(tǒng)地研究植株高效再生技術(shù)的報(bào)道。通常多細(xì)胞植物都有誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的潛在可能性[2]?但不同外植體的分化能力會(huì)有明顯的差異，其中胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率可作為分化能力的指標(biāo)[4]。本試驗(yàn)結(jié)果也印證了上述說法，即3種不同外植體間盡管都能誘導(dǎo)出愈傷組織，但不論是愈傷組織的誘導(dǎo)率還是胚性愈傷組織的形成率以及叢生芽的分化率，均表現(xiàn)出了明顯的差異，而胚性愈傷組織的形成率和叢生芽的分化率表現(xiàn)出高度的一致性，這也說明胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率作為分化率的指標(biāo)是可行的。試驗(yàn)結(jié)果也說明了胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)具有很強(qiáng)的脫分化及再分化形成再生植株的能力?是最佳的高頻外植體，為建立一個(gè)高效的翦股穎組培再生體系奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ);其次吸漲種子也可以作為一個(gè)備選外植體，但胚根生長(zhǎng)點(diǎn)太低可以淘汰掉。

較高濃度的生長(zhǎng)素和較低濃度的細(xì)胞分裂素或無細(xì)胞分裂素的固體培養(yǎng)基對(duì)大部分草坪草愈傷組織的誘導(dǎo)是沒有問題的，但是否形成胚性愈傷組織乃至能否分化出叢生芽則與外植體的年齡、生理狀態(tài)、培養(yǎng)基的組成、激素的種類和濃度、培養(yǎng)條件等有關(guān)，其中培養(yǎng)條件是關(guān)鍵[5]，尤其是激素成分及配比很重要[2]，2，4-D是誘導(dǎo)胚性愈傷組織的重要激素[6]，較高濃度的2，4-D也有利于胚性愈傷組織的形成[7-9]，但合適的激素配比及繼代時(shí)間對(duì)胚性愈傷組織的形成以及叢生芽的分化更高效;依據(jù)本試驗(yàn)的結(jié)果，分析得出高頻胚性愈傷組織形成的激素配比為2.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA;高頻叢生芽分化的激素配比為2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。高濃度的2，4-D有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，但愈傷大多為松散的高度液泡化的薄壁細(xì)胞組成，所以并不利于胚性愈傷組織的形成及叢生芽的分化，而誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入少量的6-BA和NAA反倒對(duì)胚性愈傷組織的形成起促進(jìn)作用并有利于叢生芽的分化。本試驗(yàn)的研究結(jié)果為建立一個(gè)高效的翦股穎組培再生體系提供了一條有效地途徑，圖5至圖8是翦股穎高頻組培再生植株的現(xiàn)場(chǎng)圖片。

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