張宏澤，朱俊潔，俞 丹，洪汝丹，洪 梅，劉正祥，栗冬梅，尹家祥

人粒細胞無形體病是由嗜吞噬細胞無形體(Anaplasmaphagocytophilum，AP)感染所引起的一種人獸共患病，是常見的蜱傳自然疫源性疾病[1-3]。自2006年我國安徽省發(fā)現(xiàn)首例HGA患者以來，東北、華北、華南、華中、西北及西南等多地均有HGA患者或疑似患者的報道[4-6]。云南省由于其獨特的地形地貌，成為我國多種蜱傳疾病的流行區(qū)域。梁河縣地處云南省西部橫斷山脈西南端，介于東經(jīng)98°06′～98°31′、北緯24°31′～24°58′之間，境內海拔高差達1 800 m，有中山、低山、火山錐、臺階地、河谷平壩5種地貌類型，是云南家鼠鼠疫自然疫源地區(qū)域，但尚不清楚該疫源地鼠形動物是否有無形體感染。本研究采用巢式PCR對采集自梁河縣的野外鼠形動物肝脾樣本進行擴增并對擴增產(chǎn)物進行基因序列檢測，對陽性樣本基因序列進行對比分析，旨在了解云南省梁河縣鼠疫疫源地野外鼠形動物嗜吞噬細胞無形體自然感染情況。

1 材料與方法

1.1動物樣本采集及抽樣 本研究于2015年12月至2016年10月分春、夏、秋、冬四季于梁河縣按海拔高度選取了Ⅰ海拔梯度(1 000～1 200 m)、Ⅱ海拔梯度(1 200～1 400 m)、Ⅲ海拔梯度(1 400～1 600 m)及Ⅳ海拔梯度(1 600 m以上)4個海拔梯度，每個海拔梯度段選取2～3個研究樣點進行野外捕鼠并記錄生境信息。將捕獲的665只野外鼠形動物帶回實驗室進行鼠種鑒定，無菌條件下取肝、脾臟器樣本，置于-40 ℃保存?zhèn)溆?。應用單純隨機抽樣方法抽取407份動物標本(數(shù)量少于或等于10只的鼠種全部納入)進行嗜吞噬細胞無形體檢測分析。

1.2 試劑與設備

1.2.1分子生物學檢測 磁珠法微量細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(AU19014)與核酸染料Gelview(北京百泰克生物技術有限公司)；DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)和 Nuclease-Free Water(Thermo)；DNA Marker(Biomed)；Agarose(Coolaber)。

1.2.2儀器設備 全自動核酸提取儀AU1001(北京百泰克生物技術有限公司)；核酸濃度測定儀NanoDrop-1000(Thremo)；QuantStudio3 PCR儀(Thremo)；臺式高速離心機(AndyBio)；G:Box凝膠成像系統(tǒng)(Syngene)。

1.3 方 法

1.3.1DNA提取 所有樣本DNA按照磁珠法微量細胞/組織基因組DNA提取試劑(AU19014)說明書進行操作。

1.3.2引物 根據(jù)參考文獻[7]，選取無形體屬16S rRNA基因巢式PCR通用外側引物out1：5′-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3′；out2：5′-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3′；與嗜吞噬細胞無形體特異性引物HGA1：5′-GTC GAA CGG ATT ATT CTT TAT AGC TTG-3′；HGA2：5′-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3′，由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.3.3PCR檢測 先用外側引物out1和out2對所提取的樣本DNA進行擴增，PCR第1輪擴增反應體系為PremixTaq酶12.5 μL、上下游引物各0.5 μL (10 μmol/L)、DNA模板5 μL，加無菌去離子水補至總體積25 μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min后，以95 ℃變性30 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸50 s、循環(huán)35次，72 ℃總延伸7 min。第2輪反應使用嗜吞噬細胞無形體特異性引物 HGA1和HGA2 進行擴增，反應體系為PremixTaq酶15 μL、上下游引物各0.6 μL (10 umol/L)、取第1輪擴增產(chǎn)物0.5 μL 作為模板，加無菌去離子水至總體積30 μL。反應條件同第1輪。本實驗將首份PCR擴增陽性產(chǎn)物送至上海生工生物技術公司測序；通過比對序列將其確定為嗜吞噬細胞無形體，并將此樣本擴增產(chǎn)物作為陽性對照。陰性對照模板為無菌去離子水；為避免污染，配置反應體系、PCR擴增及凝膠電泳均在不同實驗室進行，陽性對照僅用于電泳檢測目的條帶位置比較。

1.3.4電泳檢測 制備1.5%瓊脂糖凝膠后吸取第二輪PCR擴增產(chǎn)物3 μL 進行120 V、45 min電泳；使用凝膠成像系統(tǒng)對膠體成像，并拍照保存；選取單一條帶 PCR 擴增陽性產(chǎn)物直接送上海生工生物技術公司測序。

1.3.5PCR陽性產(chǎn)物測序及序列分析 通過美國國家生物技術信息中心(NCBI)站點，利用BLAST“Sequence Similarity Searching”工具，與GenBank中的無形體基因序列進行相似性比較，序列分析采用DNAStar、MEGA7.0等軟件。

1.3.6統(tǒng)計學分析 應用R軟件進行統(tǒng)計學分析，采用Chi-square Test、Fisher’s Exact Test比較不同海拔梯度、性別、生境及季節(jié)間野外鼠形動物嗜吞噬細胞無形體感染情況，檢驗水準為α=0.05。

2 結 果

2.1野外鼠形動物感染情況 本次調查共捕獲野外鼠形動物3目5科12屬17種665只，共抽取野外鼠形動物3目5科12屬17種407只進行嗜吞噬細胞無形體檢測，總陽性率為3.19%(13/407)；其中有3種野外鼠形動物感染嗜吞噬細胞無形體，即黃胸鼠(Rattustanezumi)、斯氏家鼠(Rattussteini)和大足鼠(Rattusnitidus)，其感染率分別為6%(6/100)、4.94%(4/81)和21.43%(3/14)(見表1)。

對13份野外鼠形動物陽性樣本巢式PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，均得到389 bp左右的目的片段(見圖1)，符合預計目標條帶。

2.2不同海拔梯度、性別、生境及季節(jié)間嗜吞噬細胞無形體感染情況 隨著海拔梯度升高，野外鼠形動物感染嗜吞噬細胞無形體有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.219)；不同性別野外鼠形動物感染率無統(tǒng)計學差異(χ2=0.441，P=0.506)；本次檢測的所有陽性樣本均采集自林地，但不同生境間野外鼠形動物感染率無統(tǒng)計學差異(χ2=0.386，P=0.534)；不同季節(jié)野外鼠形動物感染率差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.044)，其中春季感染率最高7.53%(7/93)(表2)。

表1 不同種類鼠形動物感染嗜吞噬細胞無形體情況

Tab.1 Infection rate ofAnaplasmaphagocytophilumin different mammals species

鼠形動物種類檢測樣本數(shù)陽性數(shù)感染率(%)黃胸鼠10066.00 斯氏家鼠8144.94 錫金小鼠4400 針毛鼠4100 臭鼩鼱3200 毛猬2800 短尾鼩2400大足鼠14321.43青毛鼠900 滇絨鼠900 大絨鼠700灰麝鼩600 樹鼩400 長尾大麝鼩300 白腹鼠200 社鼠200 板齒鼠100 合計407133.19

2.316S rRNA基因序列同源性分析 將13份陽性樣本的16S rRNA基因序列的測序結果經(jīng)Megalign對比分析，顯示本次調查所有樣本16S rRNA基因序列完全一致。使用DNAstar對所測得的序列拼接后進行BLAST，通過與GenBank中收錄的部分嗜吞噬細胞無形體相對應的片段進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)本次調查所得到的基因序列與來自中國東北(GQ412339.1)、俄羅斯(HM366583.1)、浙江(HM439430.1)、吉林(DQ449948.1)、加拿大(HG916766.1)、云南(MF134887.1)及安徽(EF211110.2)的嗜吞噬細胞無形體16S rRNA基因序列同源性為100%；與日本(AB196721.1)、韓國(AF70699.1)及湖北(HM538192.1)的無形體序列同源性分別為98.6%、98.6%及97.9%；而與意大利(EF520690.1)和韓國(GU556626.1)的無形體序列同源性分別為97.6%和96.5%(見圖2)。

注：M為DNA marker ；PC為陽性對照 ；NC為陰性對照；BC為空白對照；037-393號為陽性擴增產(chǎn)物。圖1 嗜吞噬細胞無形體巢式PCR擴增結果Fig.1 Result of nest PCR for Anaplasma phagocytophilum

表2 不同海拔梯度、性別、生境及季節(jié)間嗜吞噬細胞無形體感染情況

Tab.2 Comparison of the infection rate ofAnaplasmaphagocytophilumin different elevation gradients, gender,habitat and seasons

因素檢測樣本數(shù)陽性樣本數(shù)感染率(%)χ2值P值海拔/m0.219① 1 000～1 20011765.13 1 200～1 40011954.2 1 400～1 60011021.82 ≥1 6006100性別②0.4410.506 雌性19152.62 雄性21183.79生境0.3860.534 林地372133.49 耕地林地交界3500季節(jié)0.044① 春季9377.53 夏季7811.28 秋季12010.83 冬季11643.45

注：①Fisher’s Exact Test；②5只鼠形動物未鑒定出性別

圖2 嗜吞噬細胞無形體16S rRNA序列的同源性比較Fig.2 Homology analysis for 16S rRNA gene of Anaplasma phagocytophilum

注：△的樣本為本次檢測的梁河樣本圖3 嗜吞噬無形體16S rRNA基因序列進化分析Fig.3 Phylogentic tree based on 16S rRNA gene of Anaplasma phagocytophilum

2.416S rRNA基因序列進化分析 本次調查得到的13份陽性樣本均檢測到的389 bp左右的16S rRNA基因序列，并與GenBank收錄的部分無形體16S rRNA基因序列一起采用MEGA7.0軟件進行進化分析，進化分析采用Maximum Likelihood方法推測(見圖3)。進化分析表明本次調查所有陽性樣本基因序列與中國東北(GQ412339.1)、俄羅斯(HM366583.1)、浙江(HM439430.1)、吉林(DQ449948.1)、加拿大(HG916766.1)云南(MF134887.1)、安徽(EF211110.2)等地不同宿主動物(如鼠、蜱等)感染無形體株聚在同一分支。與日本(AB196721.1)及韓國(AF70699.1)的嗜吞噬細胞無形體株具有較高的同源性，同屬一個大分支，但相距較遠。而湖北(HM538192.1)邊緣無形體(A.marginale)、韓國(GU556626.1)牛無形體(A.bovis)、意大利(EF520690.1)中央無形體(A.centrale)則處于外圍。

3 討 論

嗜吞噬細胞無形體是一種經(jīng)蜱叮咬傳播的細胞胞漿內專性寄生菌，能侵染人末梢血中性粒細胞引起人粒細胞無形體病，其主要的傳播媒介為全溝硬蜱(Ixodespersulcatus)，可感染野鼠、狗、羊、馬及牛等宿主動物[8-11]。本次調查檢測嗜吞噬細胞無形體16S rRNA基因序列是由于該基因序列的高變區(qū)具有細菌屬、種的特征，尤其是為發(fā)現(xiàn)細胞內專性寄生菌提供了迅速精準的方法。本次實驗采用巢氏PCR方法對云南省梁河縣野外鼠形動物進行檢測，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)野外鼠形動物嗜吞噬細胞無形體感染率為3.19%，提示梁河縣為人粒細胞無形體病的自然疫源地。隨著海拔梯度升高，野外鼠形動物感染嗜吞噬細胞無形體有降低趨勢，雖然沒有統(tǒng)計學意義，但這一結果與我們前期在海拔較高的劍川縣(2250 m以上)和玉龍縣(2 400 m以上)捕獲到的野外鼠形動物嗜吞噬細胞無形體感染率較低相一致(劍川縣感染率為0，玉龍縣感染率為0.36%)，這也可能與生境特點、鼠種動物構成情況等有關，有待進一步深入研究。野外鼠形動物不同的性別及其棲息環(huán)境間嗜吞噬細胞無形體感染率無統(tǒng)計學差異，說明這兩個因素與野外鼠形動物感染嗜吞噬細胞無形體無關；不同季節(jié)野外鼠形動物嗜吞噬細胞無形體感染率差異具有統(tǒng)計學意義，但冬春季感染率較高而夏秋季較低，這一現(xiàn)象與媒介蜱的季節(jié)性消長并不一致，需進一步調查研究闡釋該現(xiàn)象出現(xiàn)的原因。

經(jīng)序列同源性分析，本次實驗檢出的13份嗜吞噬細胞無形體16S rRNA基因序列與我國云南、浙江、吉林及俄羅斯、加拿大等地檢出的7個相對應序列同源性為100%，確證本次研究測得的序列為嗜吞噬細胞無形體16S rRNA基因序列。通過與日本等國家進行嗜吞噬細胞無形體16S rRNA基因序列同源性比較發(fā)現(xiàn)所測序列與日本(AB196721.1)及韓國(AF70699.1)嗜吞噬細胞無形體基因序列具有較高的同源性，但不同地區(qū)嗜吞噬細胞無形體16S rRNA基因序列存在小幅度的變異，這可能是由于不同地區(qū)嗜吞噬細胞無形體宿主動物或媒介生物不同所致。

進化分析顯示所測序列與安徽省某醫(yī)院感染嗜吞噬細胞無形體患者血中檢測的序列(EF211110)屬同一分支，提示梁河縣境內嗜吞噬細胞無形體存在對人致病的可能[4]。此外，無形體屬其它成員湖北(HM538192.1)邊緣無形體(A.marginale)及意大利(EF520690.1)中央無形體(A.centrale)雖與嗜吞噬細胞無形體相距較遠，但同屬一個大分支，說明嗜吞噬細胞無形體與邊緣無形體(A.marginale)及中央無形體(A.centrale)親緣關系較近。

本次調查表明云南省梁河縣野外鼠形動物存在嗜吞噬細胞無形體低度感染，但尚不清楚無形體株是否能對人類致病以及與鼠疫發(fā)生和流行是否有關系，有必要進行深入研究。

(大理大學魏兆飛、趙秋芳、徐丹丹、周蕓、王夢迪參與了現(xiàn)場標本采集工作，在此表示感謝！)

利益沖突：無