王蕾，鄒琳，李夢(mèng)潔，侯琳琳，陳小明，劉偉，孫桂芹，陳力

1. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 2. 浙江省水利水電裝備表面工程技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 杭州 310024； 3. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院， 浙江 杭州 310053

細(xì)胞是生命的基本單元，顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)是細(xì)胞最重要的生物學(xué)特征。細(xì)菌是無(wú)核單倍體的單細(xì)胞生物，顯微鏡下其基本形態(tài)有球形、桿狀、弧形和螺旋形。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌基本形態(tài)之間存在相互轉(zhuǎn)化的特定機(jī)制。在合適的生長(zhǎng)條件下，細(xì)菌合成新的染色體，經(jīng)細(xì)胞分裂產(chǎn)生新的單細(xì)胞。新生細(xì)胞間的連接方式如雙球、八疊、成鏈等，是細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)的另一個(gè)主要特征。此外，細(xì)菌的形態(tài)還受培養(yǎng)條件、生存環(huán)境及宿主免疫特異性組分功能和活性的影響。細(xì)菌形態(tài)是細(xì)菌主要分類及臨床診斷的依據(jù)，由基因組、基因組表達(dá)譜及其他環(huán)境因素共同決定。在特定環(huán)境及生理?xiàng)l件下，細(xì)菌細(xì)胞具有形變能力。細(xì)菌雖小，其獨(dú)立的生命活動(dòng)卻不容忽視。其在代謝過(guò)程中產(chǎn)生抗生素、維生素等多種代謝產(chǎn)物，可為人類生產(chǎn)、生活和醫(yī)療衛(wèi)生利用。因此，細(xì)菌細(xì)胞形變研究對(duì)臨床抗生素用藥指導(dǎo)及新型抗生素研發(fā)和生產(chǎn)有重要意義。

1 細(xì)菌基本形態(tài)的轉(zhuǎn)變

細(xì)胞形態(tài)是細(xì)菌分類與鑒定的重要參數(shù)。根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞在顯微鏡下的形狀，細(xì)菌可分為球菌、桿菌、弧菌和螺菌四大類[1]。球菌的外觀呈圓形或類球形，直徑約1 μm。桿菌的基本形態(tài)為直桿狀，菌體兩端多呈鈍圓形。桿菌可細(xì)分為小桿菌(菌長(zhǎng) 0.6～1.5 μm，如布魯桿菌)、中桿菌(菌長(zhǎng)2～3 μm，如大腸埃希菌)和大桿菌(菌長(zhǎng)3～10 μm，如炭疽芽胞桿菌)。菌體呈弧形彎曲的弧菌和呈螺旋狀的螺菌也較為常見(jiàn)，其中弧菌菌體總長(zhǎng)2～3 μm，螺菌菌體總長(zhǎng)3～6 μm[2]。L型細(xì)菌和芽胞是兩種特殊的細(xì)菌形態(tài)。細(xì)菌形成球形、桿狀、弧形還是螺旋形的分子機(jī)制一直是微生物學(xué)領(lǐng)域的焦點(diǎn)之一。

1.1 桿狀與球形之間的轉(zhuǎn)變

研究表明，決定細(xì)菌形態(tài)的分子可能參與細(xì)菌分裂過(guò)程[3]。 Ogura等于1989年分離得到桿菌變?yōu)榍蚓耐蛔冎?，發(fā)現(xiàn)該突變出現(xiàn)在青霉素結(jié)合蛋白2(penicillin-binding protein 2，PBP2)上[4]。后續(xù)研究表明，由PBP蛋白功能缺陷導(dǎo)致的肽聚糖結(jié)構(gòu)改變可引起細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化[5]。2001年，Jones等發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌中MreB蛋白的缺失突變導(dǎo)致了細(xì)菌從短棒狀變成球形[6]。這一現(xiàn)象在大腸埃希菌中也得到了驗(yàn)證[7]。mreB基因突變的球形菌中，染色體分離受到影響，出現(xiàn)了染色體缺失的球狀體[8]。結(jié)果提示，MreB蛋白與細(xì)菌染色體分離相關(guān)[9]。Wachi等發(fā)現(xiàn)MreB蛋白的抑制劑A22能快速干擾MreB蛋白的多聚化和胞內(nèi)定位，導(dǎo)致細(xì)菌桿狀形態(tài)丟失甚至死亡[9-10]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，形成多聚體的MreB蛋白沿著細(xì)胞內(nèi)壁呈圓周運(yùn)動(dòng)，調(diào)控細(xì)胞壁生長(zhǎng)的空間位置來(lái)控制細(xì)菌的形態(tài)[11-14]。以上研究表明，MreB蛋白是細(xì)菌形態(tài)建立、維持和調(diào)控過(guò)程中的關(guān)鍵因子之一[15]。

1.2 弧形與桿狀之間的轉(zhuǎn)變

弧形細(xì)菌可在一定條件下轉(zhuǎn)變成桿菌。2003年，Ausmees等發(fā)現(xiàn)單基因creS的突變不影響細(xì)菌生長(zhǎng)，但可使在平臺(tái)期生長(zhǎng)的弧狀新月柄桿菌(Caulobactercrescentus)變成長(zhǎng)絲狀的桿菌[16]，并于2009年再次發(fā)現(xiàn)表達(dá)單基因creS就能導(dǎo)致大腸埃希菌呈弧形生長(zhǎng)[17]。此外，2017年Bartlett等發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌(Vibriocholerae)的CrvA蛋白突變可導(dǎo)致桿狀形變，是重要的致病因子[18]。研究發(fā)現(xiàn)，CreS或CrvA在外周質(zhì)空間中均呈不對(duì)稱分布，均僅在單側(cè)存在，調(diào)控定位一側(cè)的生長(zhǎng)速度而導(dǎo)致曲面形成[17-18]。

1.3 螺形的轉(zhuǎn)變

螺形菌幽門螺桿菌的形態(tài)突變體中，csd1基因突變引起弧形改變，csd4基因引起桿狀改變，csd3基因突變導(dǎo)致多種變形，菌體形態(tài)的改變影響了細(xì)菌在小鼠體內(nèi)的定植[19-20]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和體外實(shí)驗(yàn)表明，csd1可能編碼肽聚糖內(nèi)肽酶，csd4編碼的蛋白具有肽聚糖羧肽酶活性[21]，csd3基因也可能編碼肽聚糖內(nèi)肽酶[19]。以上結(jié)果提示，菌體彎曲和螺旋的產(chǎn)生可能是基于肽聚糖的交聯(lián)程度。

1.4 L型細(xì)菌

L型細(xì)菌或細(xì)胞壁缺陷型是指細(xì)胞壁受損但仍能生長(zhǎng)和分裂的一類特殊形態(tài)的細(xì)菌。由于肽聚糖缺失，細(xì)菌呈大小不一的球形、桿狀或絲狀等形態(tài)[2]。1935年，Klienberger首次報(bào)道了念珠狀鏈桿菌的L型菌體，發(fā)現(xiàn)其菌落和形態(tài)與支原體相類似[22]。雖然自然條件下出現(xiàn)L型細(xì)菌的機(jī)制并不清楚，但已知培養(yǎng)時(shí)持續(xù)阻斷和抑制細(xì)胞壁合成及保持培養(yǎng)基與細(xì)胞質(zhì)等滲，是穩(wěn)定誘導(dǎo)L型細(xì)菌形成的兩個(gè)要素[23-24]。研究表明，與正常細(xì)菌相比，L型細(xì)菌可能不依賴分裂中板的形成，可經(jīng)不對(duì)稱擠出-分離的方式完成增殖[25]。臨床研究中，Beaman在接種了諾卡菌的小鼠肺中觀察到了L型細(xì)菌[26-27]。2001年，Woo 等研究發(fā)現(xiàn)，造血干細(xì)胞移植手術(shù)后的患者在免疫抑制期間有被L型細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)[28]。隨后2005年研究發(fā)現(xiàn)，在使用以細(xì)胞壁為靶點(diǎn)的抗生素(如β-內(nèi)酰胺類)治療過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)導(dǎo)致慢性感染的L型細(xì)菌[29]。此外，缺失細(xì)胞壁成分可能有利于細(xì)菌獲得耐藥性[29]。2015年，Kawai 等的研究結(jié)果表明，細(xì)胞壁合成被阻斷時(shí)發(fā)生的代謝失衡生理補(bǔ)償對(duì)L型細(xì)菌的增殖至關(guān)重要，為針對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的抗生素的作用模式提供了新見(jiàn)解[30]。

1.5 芽胞

芽胞是細(xì)菌在嚴(yán)酷環(huán)境中產(chǎn)生的一種休眠狀態(tài)[31]，在營(yíng)養(yǎng)極度缺乏的條件下形成[32]。芽胞的形成由一個(gè)特殊的細(xì)胞分裂和分化過(guò)程組成。以枯草芽胞桿菌為例，在特殊的分裂過(guò)程中，經(jīng)不對(duì)稱分裂形成前芽胞和母菌。在分化過(guò)程中，經(jīng)歷以下幾個(gè)階段：芽胞包皮質(zhì)層的形成、芽胞外衣的生成、芽胞的脫水與成熟、母細(xì)菌程序性死亡后芽胞的釋放[33]。根據(jù)分裂和分化的結(jié)果，芽胞在菌體中的位置主要有3種類型：極端、中間和次極端。有關(guān)芽胞分化的分子機(jī)制研究，請(qǐng)參見(jiàn)相關(guān)綜述[32]。

2 桿菌絲狀形變的分子機(jī)制

細(xì)菌的形變可分為基本形態(tài)間的轉(zhuǎn)變和基本形態(tài)內(nèi)的變形。研究表明，桿菌絲狀形變表型的出現(xiàn)與細(xì)菌細(xì)胞周期控制點(diǎn)的失控有關(guān)。細(xì)菌的細(xì)胞周期包括3個(gè)過(guò)程：細(xì)菌的生長(zhǎng)(G期)、染色體的復(fù)制分離(S期)和細(xì)胞分裂(D期)。其中，細(xì)胞分裂由分裂中板的形成和菌體的分離兩個(gè)步驟構(gòu)成[34]。細(xì)胞對(duì)每個(gè)過(guò)程完成的質(zhì)控點(diǎn)被定義為細(xì)菌細(xì)胞周期控制點(diǎn)，其主要功能是阻止下一個(gè)過(guò)程的發(fā)生。

研究表明，S期過(guò)程受阻可導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生絲狀形變，該形變被稱為SOS絲狀形變[35-36]。SOS之所以會(huì)誘導(dǎo)出細(xì)菌的絲狀形變，是因?yàn)镾OS誘導(dǎo)后產(chǎn)生的細(xì)胞分裂抑制蛋白SulA可特異性地與細(xì)胞分裂蛋白FtsZ單體結(jié)合，從而抑制FtsZ的多聚化[37-40]，導(dǎo)致細(xì)菌正常分裂所需的“Z環(huán)”不能在分裂中板有序進(jìn)行[41]。胞內(nèi)SulA蛋白表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平受轉(zhuǎn)錄因子LexA負(fù)調(diào)控，在蛋白水平受蛋白酶Lon負(fù)調(diào)控。胞內(nèi)DNA受損導(dǎo)致LexA蛋白降解，由此啟動(dòng)SulA蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞分裂的發(fā)生[42]。當(dāng)染色體DNA損傷修復(fù)完成后，SulA蛋白被Lon蛋白酶降解，細(xì)菌分裂過(guò)程可重啟[43]。因此，SOS絲狀形變的關(guān)鍵調(diào)控因子是SulA蛋白。

細(xì)菌的染色體復(fù)制完成后，細(xì)菌進(jìn)入分裂階段。分裂過(guò)程中關(guān)鍵步驟的突變可阻止細(xì)菌進(jìn)入正常生長(zhǎng)過(guò)程，可能導(dǎo)致絲狀及其他形變。分裂蛋白FtsZ是中板形成的核心蛋白，能招募下游的其他蛋白形成分裂復(fù)合物來(lái)完成二分裂。研究發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)FtsZ蛋白的濃度至關(guān)重要。FtsZ低表達(dá)或缺陷導(dǎo)致細(xì)菌分裂受阻，發(fā)生絲狀形變；而FtsZ高表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致“小細(xì)胞”產(chǎn)生。研究表明，分裂復(fù)合物中蛋白的協(xié)調(diào)作用也非常重要，整個(gè)過(guò)程需要準(zhǔn)確的調(diào)控[44]。FtsZ/FtsA蛋白的濃度比發(fā)生異常會(huì)阻斷細(xì)菌的正常分裂，形成絲狀細(xì)菌[45-47]。其他分裂復(fù)合物蛋白發(fā)生突變或異常也可能導(dǎo)致細(xì)菌的(長(zhǎng))絲狀形變[48-49]。

細(xì)胞分裂的第二個(gè)關(guān)鍵步驟是細(xì)菌細(xì)胞壁的合成和分離。Miller等報(bào)道，細(xì)胞壁合成過(guò)程受阻時(shí)，細(xì)菌發(fā)生絲狀形變[50]。Jiang 等使用理論模型來(lái)描述細(xì)胞壁生長(zhǎng)與細(xì)胞骨架細(xì)絲在塑造細(xì)菌細(xì)胞形狀過(guò)程中的相互作用，證明了細(xì)菌中細(xì)胞骨架蛋白MreB控制細(xì)胞形態(tài)并確定細(xì)胞呈球形還是棒狀，缺失MreB的生長(zhǎng)細(xì)胞表現(xiàn)出有利于向球形細(xì)胞發(fā)展的不穩(wěn)定性，MreB可機(jī)械加固細(xì)胞壁并防止不穩(wěn)定的發(fā)生。該模型證實(shí)有和沒(méi)有MreB的形態(tài)變換是可逆的，并定量描述了不規(guī)則形狀的細(xì)胞生長(zhǎng)模式和正在經(jīng)歷分裂的細(xì)胞生長(zhǎng)模式[51]。

3 細(xì)菌絲狀形變的生物學(xué)及臨床意義

現(xiàn)有研究提示，細(xì)菌絲狀形變是其一種生存策略。細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)缺陷[52]、放射性污染[35,37]、被宿主免疫系統(tǒng)攻擊[53-54]及臨床抗生素處理[50,55]等條件下，均會(huì)產(chǎn)生絲狀形變，相關(guān)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究是現(xiàn)代微生物學(xué)研究的焦點(diǎn)之一[56]。

3.1 營(yíng)養(yǎng)缺陷

細(xì)菌在艱難的環(huán)境中“夾縫求生”，對(duì)其生存最大的威脅就是單一或多種營(yíng)養(yǎng)的缺失，在這種情況下細(xì)菌經(jīng)常以絲狀形變來(lái)應(yīng)對(duì)。細(xì)菌絲狀形變?cè)黾恿藛蝹€(gè)細(xì)菌的表面積，提高了細(xì)菌的吸收和吸附能力[57]。例如，鏈球菌細(xì)胞壁合成需維生素B6，維生素B6突變株呈絲狀生長(zhǎng)[58]。在消耗型營(yíng)養(yǎng)缺失的條件下，DNA合成底物缺少，導(dǎo)致染色質(zhì)受損，細(xì)菌誘導(dǎo)出SOS反應(yīng)，出現(xiàn)絲狀生長(zhǎng)[59]。

3.2 紫外線照射

細(xì)菌受到紫外線照射時(shí)，會(huì)產(chǎn)生DNA損傷[36]，DNA損傷誘導(dǎo)SOS反應(yīng)，阻斷細(xì)菌分裂發(fā)生，導(dǎo)致細(xì)菌絲狀生長(zhǎng)[35]。絲狀細(xì)菌中發(fā)生的DNA修復(fù)及修復(fù)過(guò)程中產(chǎn)生的突變，均能提高細(xì)菌在不利環(huán)境中生存的可能性，提示絲狀形變的產(chǎn)生可能是細(xì)菌應(yīng)對(duì)放射性污染的重要機(jī)制。

3.3 逃逸宿主免疫系統(tǒng)

病原體進(jìn)入機(jī)體后，受到人體免疫系統(tǒng)細(xì)胞和因子的攻擊。研究表明，細(xì)菌可能通過(guò)絲狀形變來(lái)應(yīng)對(duì)免疫系統(tǒng)的壓力[54]。2004年，Justice等報(bào)道了尿道致病性大腸埃希菌(uropathogenicEscherichiacoli，UPEC)感染表面膀胱上皮細(xì)胞，胞內(nèi)感染的UPEC可從桿狀變成長(zhǎng)絲狀，并從上皮細(xì)胞中逃離出來(lái)，成為感染周邊細(xì)胞的主力軍[60]。逃離出來(lái)的長(zhǎng)絲狀細(xì)菌可抵抗宿主免疫細(xì)胞的吞噬，在大腸埃希菌的致病性中起關(guān)鍵作用[61]。UPEC長(zhǎng)絲狀形成的機(jī)制是受SulA蛋白調(diào)控，但誘因尚未明確[54]。其他研究表明，免疫細(xì)胞中釋放的一氧化氮(nitric oxide，NO)可能是細(xì)菌在宿主細(xì)胞中出現(xiàn)長(zhǎng)絲狀生長(zhǎng)的一個(gè)原因。NO可導(dǎo)致細(xì)菌基因組斷裂，引起DNA損傷，從而誘導(dǎo)SOS反應(yīng)[53]，使細(xì)菌獲得生存的機(jī)會(huì)。

細(xì)菌以絲狀形變應(yīng)對(duì)宿主免疫攻擊的策略也被用于應(yīng)對(duì)天然捕食者。研究發(fā)現(xiàn)，四膜蟲(chóng)只能捕食短于15 μm的細(xì)菌。當(dāng)四膜蟲(chóng)以液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)為食物時(shí)，中間長(zhǎng)度的細(xì)菌(2～10 μm)被捕食5 h后占比從46%減少為0；>30 μm的細(xì)菌占比從4%上升至50%[62]。同樣的長(zhǎng)絲狀形變也在彎桿菌屬(Flectobacillusspp.)被赭球蟲(chóng)(Ochromonassp.)捕食時(shí)出現(xiàn)[63]。在自然環(huán)境中，細(xì)菌被捕食時(shí)出現(xiàn)絲狀形變的機(jī)制尚不清楚。

3.4 長(zhǎng)絲狀形變與耐藥

目前臨床面臨著非常嚴(yán)峻的耐藥問(wèn)題。研究表明，細(xì)菌通過(guò)絲狀形變可獲得耐藥性或降低對(duì)抗生素的敏感度。

環(huán)丙沙星和喹諾酮類抗生素通過(guò)作用于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶來(lái)抑制細(xì)菌染色體的復(fù)制[64]。在高劑量抗生素作用下，98%的細(xì)菌被殺死，留下一小部分長(zhǎng)絲狀生長(zhǎng)的細(xì)菌[65]。低劑量時(shí)，基本上所有細(xì)菌呈長(zhǎng)絲狀生長(zhǎng)狀態(tài)，并伴隨著耐藥突變體的出現(xiàn)[66]。2015年，Bos等發(fā)現(xiàn)在最低抑制濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)為 0.125 mg/L 的環(huán)丙沙星處理下，細(xì)菌發(fā)生了絲狀形變，并觀察到絲狀菌頂端發(fā)生了不對(duì)稱分裂，產(chǎn)生了單細(xì)菌。與初始細(xì)菌相比，通過(guò)過(guò)濾分離得到的單細(xì)菌的耐藥菌比率增加了250倍[66]。研究發(fā)現(xiàn)，喹諾酮類抗生素通過(guò)阻斷染色體復(fù)制引發(fā)SOS反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)菌絲狀形變的發(fā)生[67]。Cirz等通過(guò)在細(xì)菌中表達(dá)不能被降解的LexA蛋白，抑制細(xì)菌SOS反應(yīng)，阻斷了耐藥菌的出現(xiàn)[68]。結(jié)果提示，細(xì)菌的耐藥性可能是通過(guò)SOS絲狀細(xì)菌中DNA損傷修復(fù)機(jī)制獲得的。

此外，在某些β-內(nèi)酰胺類抗生素處理下，細(xì)菌會(huì)出現(xiàn)一群停止生長(zhǎng)或保持低速率生長(zhǎng)的亞群，該亞群對(duì)抗生素的敏感度下降[69]。2004年，Miller等證明氨芐西林通過(guò)DpiBA雙信號(hào)系統(tǒng)介導(dǎo)細(xì)菌的絲狀生長(zhǎng)，并進(jìn)化出耐藥的非遺傳性突變[50]。氨芐西林通過(guò)抑制細(xì)胞壁合成干擾細(xì)菌分裂而導(dǎo)致長(zhǎng)絲狀形態(tài)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢甚至不生長(zhǎng)，可提高細(xì)菌存活率。

在以上不適合細(xì)菌生長(zhǎng)的情況下，細(xì)菌可能通過(guò)SOS反應(yīng)觸發(fā)細(xì)菌中DNA損傷修復(fù)機(jī)制(這是一種準(zhǔn)確性差的修復(fù)方式，在修復(fù)的同時(shí)可抑制細(xì)胞分裂，細(xì)胞只生長(zhǎng)但不復(fù)制)，獲得更多的修復(fù)時(shí)間，以致發(fā)生絲狀形變并同時(shí)產(chǎn)生高頻度的基因變異。對(duì)細(xì)菌來(lái)說(shuō)，這個(gè)條件既可是致命的，也可是置之死地而后生的，例如細(xì)菌耐藥性很有可能由此獲得。自然環(huán)境中細(xì)菌被捕食時(shí)出現(xiàn)絲狀形變的機(jī)制尚不清楚，提示需對(duì)細(xì)菌出現(xiàn)絲狀形變及細(xì)菌自我保護(hù)機(jī)制進(jìn)一步研究，這對(duì)解決細(xì)菌耐藥性、尋找新的抗菌藥物或抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的新的作用靶點(diǎn)均具有重要意義。

4 結(jié)語(yǔ)

細(xì)菌的形態(tài)與形態(tài)改變具有重要的生物學(xué)及臨床意義。早期研究認(rèn)為，大多數(shù)的形態(tài)改變是致死條件下的病態(tài)或?yàn)l死的表型；隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的形變可能是應(yīng)對(duì)不利環(huán)境的一種適應(yīng)或生存的策略。但我們認(rèn)為，除了面對(duì)死亡或求生之外，還有其他驅(qū)動(dòng)細(xì)菌形變的機(jī)制存在。

盡管細(xì)菌形態(tài)改變機(jī)制尚未完全清楚，但已有的機(jī)制研究提示其對(duì)控制感染有重要意義。細(xì)菌通過(guò)絲狀形變逃逸宿主免疫系統(tǒng)，并在抗生素處理后產(chǎn)生耐藥。對(duì)抗生素所致細(xì)菌形態(tài)改變的深入研究，可幫助臨床合理使用抗生素以控制感染；此外，細(xì)菌的不同形態(tài)改變也可作為新型抗生素篩選的重要指標(biāo)。