霍中中 馮流星 李紅梅 熊金平

摘?要?采用液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜（HPLC-ID-ICPMS）在線聯(lián)用技術(shù)，通過對(duì)β淀粉樣多肽中硫元素的測(cè)定，實(shí)現(xiàn)了β淀粉樣多肽的準(zhǔn)確定量分析。首先通過優(yōu)化4種液相色譜條件，將β淀粉樣多肽純品中的Aβ42與雜質(zhì)進(jìn)行分離，然后將液相洗脫液與34S稀釋劑在線混合，針對(duì)34S稀釋劑對(duì)34S/32S信號(hào)強(qiáng)度和靈敏度的影響，對(duì)34S稀釋劑的流速進(jìn)行了優(yōu)化，并根據(jù)同位素稀釋法的公式以及Aβ42中硫元素含量，得到β淀粉樣多肽中Aβ42的含量為（0.763±0.004） g/g。本方法在5～60 μg/g范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)為0.999，檢出限為140 pg/g，定量限為467 pg/g，目標(biāo)物的回收率均在98%～105% 之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于6%。本樣品采用氨基酸水解法的測(cè)量結(jié)果為（0.768±0.009） g/g，兩種方法的測(cè)量結(jié)果一致性良好。

關(guān)鍵詞?β淀粉樣多肽; 硫元素; 絕對(duì)定量; 同位素稀釋法

1?引 言

阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease，AD）是不可逆的神經(jīng)退行性疾病，隨著人口的老齡化，AD的發(fā)病率越來(lái)越高，AD病的致病機(jī)理和臨床治療也引起了廣泛關(guān)注[1～3]。 臨床研究表明，血液、腦脊液和腦組織內(nèi)的β淀粉樣多肽（β amyloid peptide，Aβ42）水平異常與AD的進(jìn)程密切相關(guān)，Aβ42已成為目前研究AD的重要生物標(biāo)志物之一[4]。因此，建立絕對(duì)定量分析Aβ42的方法對(duì)AD的早期診斷及藥物研發(fā)有重要意義。

Aβ42由42個(gè)氨基酸組成，由淀粉樣前體蛋白經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶水解產(chǎn)生，Aβ42約占水解產(chǎn)物的10% [5]。目前，文獻(xiàn)中報(bào)道的臨床檢驗(yàn)中針對(duì)Aβ42的定量方法有酶聯(lián)免疫法[6]、電化學(xué)方法[7]、磁珠標(biāo)記結(jié)合電子發(fā)射斷層顯像法[8]、毛細(xì)管電泳法[9]等。但這些方法都是相對(duì)測(cè)量法，不同方法之間的檢測(cè)結(jié)果差異較大。Aβ42純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)位于溯源鏈的頂端，是基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溯源源頭。溯源性是指通過一條具有規(guī)定不確定度的不間斷的比較鏈，使測(cè)量結(jié)果或測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的值，能夠與規(guī)定的參考標(biāo)準(zhǔn)通常是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)系起來(lái)的特性，計(jì)量學(xué)溯源性的理想終點(diǎn)是國(guó)際單位制系統(tǒng)（SI）。因此，亟需建立具有高準(zhǔn)確度、高精密度、可溯源到SI單位的純品Aβ42絕對(duì)定量參考測(cè)量方法。

純品蛋白質(zhì)的定量方法主要分為兩類：氨基酸水解法（Amino acid hydrlysis analysis，AAA）和肽段酶解法[10]。氨基酸水解法中選擇待測(cè)蛋白水解后的2種以上氨基酸，通過定量測(cè)定氨基酸實(shí)現(xiàn)純品蛋白質(zhì)的定量分析，但是，雜質(zhì)肽段水解后的氨基酸可能對(duì)定量分析有影響。肽段酶解法定量分析是通過定量分析酶切后特異性肽段實(shí)現(xiàn)純品蛋白的定量分析，該方法可避免雜質(zhì)肽段水解的氨基酸對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，但酶解法需要合成同位素標(biāo)記的目標(biāo)肽段，并進(jìn)行濃度認(rèn)證，該過程會(huì)使最后定量分析結(jié)果的不確定度增大。

電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法靈敏度高，檢測(cè)范圍廣，樣品處理簡(jiǎn)單，易與色譜聯(lián)用。另外，ICP-MS可同時(shí)測(cè)定一種元素的不同同位素的能力使其應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的絕對(duì)定量分析成為可能[11]。根據(jù)Swiss Prot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的統(tǒng)計(jì)分析，分別有96.6%和98.8%的蛋白質(zhì)含有半胱氨酸、甲硫氨酸等含硫氨基酸[12]。如蛋白質(zhì)的氨基酸序列已知，則可通過定量分析硫含量實(shí)現(xiàn)蛋白的定量分析[13]。同位素稀釋法（ID）是國(guó)際公認(rèn)的化學(xué)計(jì)量方法，在樣品處理前，向待測(cè)溶液中加入同位素豐度已知的稀釋劑溶液，通過直接測(cè)定目標(biāo)元素在待測(cè)混合物中的同位素比值變化[14]，可實(shí)現(xiàn)待測(cè)元素的定量分析[15～17]。與傳統(tǒng)的定量分析方法相比，同位素稀釋法可避免樣品處理中的損失對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響[18]，其測(cè)量結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，且可直接溯源到SI單位[19]，因此在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值及國(guó)際比對(duì)中應(yīng)用廣泛。基于HPLC-ID-ICPMS定量分析蛋白有許多優(yōu)點(diǎn)[20]。在測(cè)定Aβ42中硫元素含量時(shí)，采用柱后在線連續(xù)添加已知的濃度34S同位素稀釋劑，通過在線連續(xù)監(jiān)測(cè)32S/34S的信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間變化，積分同位素信號(hào)強(qiáng)度與時(shí)間坐標(biāo)軸形成的峰面積，結(jié)合同位素稀釋方程，可直接計(jì)算硫元素的含量[21]，進(jìn)一步結(jié)合蛋白質(zhì)的分子量及所含硫元素的含量，最終實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量分析。鑒于ICP電離幾乎與物種無(wú)關(guān)的性質(zhì)，并且通常在色譜分離后加入標(biāo)準(zhǔn)品，因此，實(shí)驗(yàn)過程中無(wú)需匹配與待測(cè)樣品類型相同（標(biāo)記的或非標(biāo)記的）的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[22]。

本研究采用硫元素同位素稀釋法定量分析β淀粉樣多肽中Aβ42含量。通過優(yōu)化4種液相色譜條件，最終確定20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4（64∶36，V/V）為流動(dòng)相時(shí)分離效果最好。在此條件下，將β淀粉樣多肽純品中的Aβ42與雜質(zhì)分離，34S稀釋劑與液相洗脫液在線混合，基于34S稀釋劑對(duì)34S/32S信號(hào)強(qiáng)度和靈敏度的影響對(duì)34S稀釋劑的流速進(jìn)行了優(yōu)化，根據(jù)同位素稀釋法的公式以及Aβ42中硫元素的含量，得到β淀粉樣多肽中Aβ42的含量，本方法測(cè)量結(jié)果與氨基酸定量分析結(jié)果一致。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

Element Ⅱ型扇形磁場(chǎng)電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）; 高效液相色譜系統(tǒng)（日本Shimadzu公司），配 LC-30AD 泵、LC-20AD 泵、SIL-30AC 自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A 柱溫箱和SPD-20A 紫外檢測(cè)器; 6410QQQ液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó) Agilent公司）; Toledo 型電子天平（瑞士Mettler公司）; Mill-Q 超純水系統(tǒng)（美國(guó) Millipore公司）。

β淀粉樣多肽（95%，上海吉爾生化公司）; 34S 濃縮同位素（美國(guó)橡樹嶺實(shí)驗(yàn)室）; 丙氨酸（99.4%，GBW（E）100054）、纈氨酸（99.4%，GBW（E）100055）、苯丙氨酸（99.9%，GBW（E）100061）和水中硫酸鹽硫含量及同位素（32S、33S和34S）溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）082519）來(lái)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院; 標(biāo)記丙氨酸（13C3，99%; 15N，99%）、標(biāo)記纈氨酸（13C5，98%; 15N，98%）、標(biāo)記苯丙氨酸（13C9，99%; 15N，99%）來(lái)自美國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室（CIL）; 甲酸、乙腈、甲酸銨、乙酸銨、NaH2PO4、Na2HPO4（美國(guó)Fisher Scientific 公司）; HCl為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純?cè)噭? 實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

2.2?同位素稀釋劑、標(biāo)準(zhǔn)混合溶液及待測(cè)樣品溶液

兩種同位素稀釋劑： 34S稀釋劑和標(biāo)記氨基酸稀釋劑，其中34S稀釋劑濃度為328.81 μg/g，同位素32S/34S 豐度比為0.01417; 標(biāo)記氨基酸稀釋劑為標(biāo)記丙氨酸（L-Ala，0.078 μg/g）、標(biāo)記纈氨酸（L-Val，濃度0.150 μg/g）、標(biāo)記苯丙氨酸（L-Phe，0.110 μg/g）混合溶液。

標(biāo)準(zhǔn)混合溶液：濃度為100 μg/g的32S 與34S混合溶液（同位素豐度比1∶1）; 氨基酸儲(chǔ)備液： 1 mg/g的丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、苯丙氨酸（Phe）溶液。

待測(cè)樣品溶液：取1 mg/g β淀粉樣多肽溶液，用超純水稀釋至0.1 和0.001 mg/g，用于硫元素定量分析實(shí)驗(yàn)。

2.3?樣品前處理

稱取上述0.001 mg/g β淀粉樣多肽溶液約1.0000 g，加入標(biāo)記氨基酸稀釋劑約1.0000 g，其中稀釋劑的加入量與目標(biāo)多肽水解后的選定的氨基酸質(zhì)量比為1∶1，真空干燥，去除溶劑。然后加入0.5 mL 6 mol/L HCl，混合均勻后，通氮除氧，密封處理。將上述溶液在 110℃烘箱中水解，每隔 6 h渦旋混勻1次。水解24 h后取出，氮?dú)獯蹈?，用含?.1% HCl溶液復(fù)溶，溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，用于氨基酸定量分析實(shí)驗(yàn)。

2.4?硫元素定量分析實(shí)驗(yàn)

2.4.1?色譜條件?色譜柱：TSK-gel G3000SWxl （7.8 mm×300 mm）; 柱溫30℃; 進(jìn)樣體積10 μL; 流速0.5 mL/min; 流動(dòng)相：20 mmol NaH2PO4-Na2HPO4（64∶36，V/V）等度洗脫; 紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)220 nm。

2.4.2?質(zhì)譜條件?儀器工作參數(shù)為：功率1300 W，樣品氣流速1.05 L/min，輔助氣流速0.87 L/min，冷卻氣流速16.0 L/min，分辨率（m/Δm） 4000，掃描次數(shù) 700 × 1。

2.4.3?硫元素測(cè)定?采用硫元素同位素稀釋法測(cè)定Aβ42中硫元素含量時(shí)，先用S標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)34S稀釋劑濃度，實(shí)驗(yàn)獲得的溶液中32S/34S同位素比，帶入公式（1）[23]即可得到校準(zhǔn)后34S稀釋劑濃度。

式中，Rz、Ry和Rb分別表示待測(cè)樣品、稀釋劑和混合后樣品中被選定的兩個(gè)同位素的豐度比; Riy和Riz分別表示稀釋劑和待測(cè)樣品中第i個(gè)同位素與參考同位素的同位素豐度比; n是最大同位素的序號(hào); my和mz 分別為混合時(shí)稀釋劑、待測(cè)樣品的質(zhì)量; cy和cz 分別為稀釋劑、待測(cè)樣品的濃度; Mi為第i個(gè)同位素的相對(duì)原子質(zhì)量。

測(cè)Aβ42中硫的含量時(shí)，通過島津液相系統(tǒng)自帶的 LC-20AD 泵加入34S稀釋劑，液相色譜的洗脫液與在線添加的34S稀釋劑經(jīng)過三通混合后進(jìn)入 ICP-MS，在線檢測(cè)混合溶液中32S/34S同位素比。結(jié)合Aβ42的氨基酸序列，一分子Aβ42中有一個(gè)S原子，用公式（2）將32S/34S同位素比轉(zhuǎn)換成質(zhì)量流速，通過式（3）積分得到每個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的S元素的質(zhì)量。

式中，Rs、Rsp和Rm分別表示待測(cè)樣品、稀釋劑和混合后樣品中32S/34S的豐度比; csp、dsp和 fsp分別代表同位素稀釋劑的濃度（μg/g）、密度（g/mL） 和流速（mL/min）; Abs和Absp分別表示樣品和稀釋劑中核素34S的豐度; Ms和Msp分別表示樣品和稀釋劑的相對(duì)原子質(zhì)量，MFS表示S質(zhì)量流速，mS表示每個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的S的質(zhì)量。

2.5?氨基酸定量分析實(shí)驗(yàn)

2.5.1?色譜條件?色譜柱： KINETEX C18 （100 mm× 2.1 mm，1.7 μm），柱溫20℃;?進(jìn)樣體積10 μL; 流速0.2 mL/min;?流動(dòng)相： A為0.1%甲酸溶液，B為0.1% 甲酸-乙腈溶液，等度洗脫（VA∶VB=9∶1）。

2.5.2?質(zhì)譜條件?多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）; 監(jiān)測(cè)離子對(duì)：m/z 90/44.1（Ala），m/z 94/47.1（L-Ala），m/z 117.1/72.1（Val），m/z 124.0/77.1（L-Val），m/z 166.0/120.3（Phe），m/z 176.0/129.3（L-Phe）。

2.5.3?氨基酸測(cè)定?氨基酸水解法測(cè)定β淀粉樣多肽純度實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)上述的色譜和質(zhì)譜條件，將水解后的Aβ42與已知濃度的標(biāo)記氨基酸稀釋劑的混合溶液的MRM模式進(jìn)行檢測(cè)。其中，目標(biāo)氨基酸選擇易水解且水解后相對(duì)穩(wěn)定的3種氨基酸（丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、苯丙氨酸（Phe））。實(shí)驗(yàn)獲得的標(biāo)記氨基酸與天然氨基酸峰面積比，通過式（4）得到質(zhì)譜峰面積與混合溶液中氨基酸質(zhì)量的關(guān)系，計(jì)算得到Aβ42中3種氨基酸質(zhì)量，再依據(jù)式（5）中各氨基酸與Aβ42物質(zhì)的量的關(guān)系，得到β淀粉樣多肽中Aβ42的濃度。

其中，IL和IN是標(biāo)記氨基酸和未標(biāo)記氨基酸峰面積; Ix是Aβ42水解的的氨基酸峰面積; mN和mL是未標(biāo)記氨基酸和標(biāo)記氨基酸的質(zhì)量; mx是Aβ42水解的氨基酸的質(zhì)量; s和c分別表示待測(cè)多肽和校準(zhǔn)樣品; MAA和M分別為氨基酸和Aβ42的相對(duì)分子質(zhì)量; n是Aβ42中相應(yīng)氨基酸的個(gè)數(shù);?m是β淀粉樣多肽質(zhì)量; C是β淀粉樣多肽中Aβ42的濃度（g/g），取3種氨基酸（Ala、Val和Phe）計(jì)算的平均值。

3?結(jié)果與討論

3.1?硫元素定量分析結(jié)果

3.1.1?HPLC-ID-ICPMS定量Aβ42中硫含量?為了分離出β淀粉樣多肽中Aβ42，選用甲酸銨（A）、乙酸銨（B）、Na2HPO4（C）、NaH2PO4（D）溶液做流動(dòng)相，液相色譜-UV在220?nm處檢測(cè)吸收強(qiáng)度，結(jié)果如圖1所示，甲酸銨（A）和NaH2PO4（D）將主峰前的雜質(zhì)洗脫;乙酸銨（B）中雜質(zhì)和Aβ42未分離;Na2HPO4（C）較乙酸銨（B）洗脫效果較好。根據(jù)Aβ42的等電點(diǎn)pI=5.3，酸性可能引起聚集效應(yīng)，堿性可能破壞Aβ42的結(jié)構(gòu)。因此，進(jìn)一步優(yōu)化Na2HPO4和NaH2PO4兩者的比例，最后確定流動(dòng)相的組成為20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4（64∶36，V/V，pH 6.8），在此流動(dòng)相下的液相色譜圖如圖1E所示。需要注意的是，為保證稀釋劑和液相洗脫液均勻混合，需在液相色譜進(jìn)樣前，使質(zhì)譜中32S和34S信號(hào)保持穩(wěn)定。

通過空白樣品中32S的信號(hào)確定在線添加34S的濃度為3 μg/g。圖2顯示了HPLC流動(dòng)相中34S

的流速對(duì)34S/32S的比值和34S靈敏度的影響，稀釋劑為3 μg/g時(shí)，改變34S的流速，靈敏度基本不變，34S/32S的比值在0.6 mL/min時(shí)最大，之后繼續(xù)增大稀釋劑流速，34S/32S的信號(hào)強(qiáng)度減弱，流速過大時(shí)，質(zhì)譜霧化器的霧化效率過低，并且稀釋劑和流動(dòng)相混合不均勻，導(dǎo)致34S信號(hào)減弱。因此，34S的最佳流速為0.6 mL/min。

如圖1E所示，Aβ42和雜質(zhì)在15 min內(nèi)成功分離，在220 nm處檢測(cè)吸收強(qiáng)度，34S 同位素稀釋劑與液相洗脫液經(jīng)三通混合后，進(jìn)入 ICP-MS，在線檢測(cè)32S/34S信號(hào)強(qiáng)度，譜圖如圖3所示。根據(jù)同位素稀釋法公式（2），將同位素比值譜圖轉(zhuǎn)化為硫元素的質(zhì)量流譜圖，根據(jù)公式（3）對(duì)Aβ42主峰積分，得到多肽中硫元素的含量為5412.022 μg/g，結(jié)合Aβ42所含硫原子數(shù)及進(jìn)樣體積，計(jì)算出其中Aβ42為（0.763±0.004） g/g。

3.1.2?線性范圍、檢出限和定量限?在5～60 μg/g濃度范圍內(nèi)，硫元素含量（y，單位μg）與β淀粉樣多肽溶液濃度（x，單位g/g）呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y=5417x-5，相關(guān)系數(shù)為0.999。因此，采用本方法可實(shí)現(xiàn)β淀粉樣多肽的高精度檢測(cè)。另外，截距的95%CI（0.069～0.087）包括零，表明可基于單點(diǎn)校準(zhǔn)方法進(jìn)行量化分析。為保證多肽在色譜柱的洗脫效果，并避免高濃度的多肽溶液造成霧化器堵塞，本方法適用濃度不宜過大，多肽溶液最佳濃度范圍為1～100 μg/g。測(cè)定空白樣品基質(zhì)基線噪聲，以3倍噪聲峰高對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限，以10倍噪聲峰高對(duì)應(yīng)的濃度為定量限，據(jù)此計(jì)算硫元素定量分析方法的檢出限為140 pg/g，定量限為467 pg/g。

3.1.3?精密度?為了保證該方法的重復(fù)性，如表1所示，通過日內(nèi)精密度（n=6），日間精密度（n=6）和不同濃度水平（n=6），并結(jié)合C檢驗(yàn)評(píng)估本方法的精密度。其中，不同濃度水平考察實(shí)驗(yàn)以日內(nèi)和日間精密度實(shí)驗(yàn)樣品量為100%，分別考察80%和120%濃度水平對(duì)本方法的影響。C檢驗(yàn)（95%置信水平）結(jié)果表明，天數(shù)和濃度之間的差異是均勻的，且對(duì)本方法沒有影響。此外，實(shí)驗(yàn)中所有的C值都未超過臨界值C（α，m，f），表明本方法的精密度較高。

3.2?方法驗(yàn)證

3.2.1?氨基酸水解法定量分析結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)氨基酸完全分離且響應(yīng)強(qiáng)度較高，MRM模式下3種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的質(zhì)譜圖見圖4A。3種氨基酸均在10 min內(nèi)洗脫，不會(huì)對(duì)下一個(gè)樣品測(cè)定產(chǎn)生干擾。實(shí)驗(yàn)過程中待測(cè)樣品的注射濃度為0.001 mg/g，儀器對(duì)此濃度響應(yīng)良好。按照標(biāo)準(zhǔn)混合溶液、待測(cè)樣品的順序測(cè)定，通過標(biāo)準(zhǔn)混合溶液計(jì)算Aβ42純度，所述標(biāo)準(zhǔn)混合溶液由經(jīng)認(rèn)證的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和等量標(biāo)記的氨基酸組成，待測(cè)樣品由Aβ42水解的天然氨基酸與同位素標(biāo)記的氨基酸組成。

如圖4B所示，3種氨基酸的定量分析結(jié)果分別為（0.743+0.011） g/g、（0.773+0.013） g/g、（0.751+0.019） g/g，定量分析結(jié)果的RSD<5%。取3種氨基酸定量分析結(jié)果的平均值，得到氨基酸水解法的測(cè)量結(jié)果為（0.768±0.009） g/g。氨基酸的水解效率對(duì)定量分析結(jié)果有一定的影響[24]，水解時(shí)間相同的情況下，不同氨基酸水解效率不同，實(shí)驗(yàn)的水解條件為強(qiáng)酸環(huán)境，丙氨酸耐酸性差[25]，造成結(jié)果偏低。因纈氨酸的定量分析結(jié)果略大，推測(cè)雜質(zhì)肽段中可能含有纈氨酸。

3.2.2?兩種定量分析結(jié)果對(duì)比?如圖5所示，硫元素定量分析方法的分析結(jié)果為（0.763±0.004） g/g，與氨基酸水解法（0.768±0.009） g/g一致，且均低于商品給定的液相色譜純度95%。由圖5可知，硫元素定量分析結(jié)果略低于氨基酸水解法，造成此現(xiàn)象的原因是目標(biāo)氨基酸不僅限于Aβ42中，雜質(zhì)肽段也可能含有目標(biāo)氨基酸，這也是傳統(tǒng)氨基酸水解法的局限性[26]。另外，采用硫元素定量分析方法的不確定度更小，氨基酸水解法的定量分析結(jié)果通常取選定氨基酸的平均值，然而，應(yīng)該注意的是，盡管采用針對(duì)Aβ42的最佳水解條件，但3種氨基酸的定量分析結(jié)果依然會(huì)存在偏差，綜合雜質(zhì)肽段相應(yīng)氨基酸引入的誤差[27]，所以后者的不確定度更大，且測(cè)量結(jié)果偏高。

硫元素定量分析β淀粉樣多肽實(shí)驗(yàn)，比氨基酸水解或肽段法定量分析純品蛋白有一定的優(yōu)勢(shì)。一方面，對(duì)于氨基酸水解法，彌補(bǔ)了雜質(zhì)肽段水解后對(duì)定量分析的氨基酸影響[28]，對(duì)肽段定量分析法，彌補(bǔ)了酶切條件優(yōu)化困難、尋找目標(biāo)肽段復(fù)雜、目標(biāo)肽段合成和濃度認(rèn)證存在誤差的不足; 另一方面，基于硫元素的分析方法比肽段法更直接追溯到SI單位。前者能夠通過多肽中的硫含量溯源至SI，而后者中用作定量分析的肽段首先需進(jìn)行合成和濃度表征。硫元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比實(shí)驗(yàn)中表征的肽段的不確定度更小，因此，基于硫元素的分析方法可使不確定度最小化。

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