白文靜 潘勇 吳麗芳 項(xiàng)延包

耳聾是我國(guó)高發(fā)的出生缺陷疾病之一，在新生兒中的發(fā)病率為1‰～3‰，其致病因素包括環(huán)境和遺傳兩大類，其中遺傳因素占50%以上[1-3]。我國(guó)耳聾患者最常見(jiàn)的致聾基因?yàn)?GJB2、SLC26A4、GJB3及線粒體 12S rRNA等4種，其中SLC26A4基因在耳聾患者中的突變檢出率為5%～15%[4-7]。迄今已報(bào)道SLC26A4基因致病突變 460余種（http://deafnessvariationdatabase.org/）。由于該基因較大（包含21個(gè)外顯子）且具有很強(qiáng)的遺傳異質(zhì)性，常表現(xiàn)為不同耳聾群體具有不同的突變圖譜。因此，通過(guò)檢測(cè)與分析不同地區(qū)耳聾群體的SLC26A4基因突變，以尋找不同群體的突變熱點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)整不同耳聾群體的檢測(cè)策略。本研究采用Sanger測(cè)序技術(shù)檢測(cè)187例非綜合征型耳聾患者的SLC26A4基因突變情況，以探討溫州地區(qū)耳聾患者的SLC26A4基因突變檢出率及基因突變圖譜。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2011年1月至2017年12月在本院門(mén)診就診的187例耳聾患者臨床資料及外周血樣本。其中男108例，女79例；均以聽(tīng)力損失為唯一臨床表型；臨床診斷均為非綜合征型雙耳感音神經(jīng)性耳聾，聽(tīng)力分別為輕度（聽(tīng)力閾值＞25～40dB）至極重度（聽(tīng)力閾值＞90 dB）聽(tīng)損不等。

1.2 方法 采用QIAGEN公司QIAamp DNA Mini Kit抽提試劑盒，抽提耳聾患者外周血DNA；各取2μl DNA樣本，使用紫外分光光度計(jì)分別進(jìn)行定量和純度檢測(cè)。參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]，對(duì)SLC26A4基因第7、8、19外顯子及其與內(nèi)含子交界處的50bp進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序檢測(cè)，若上述片段范圍內(nèi)檢出純合或復(fù)合雜合雙等位基因突變以及未檢出任何突變，則進(jìn)入結(jié)果統(tǒng)計(jì)；若上述片段范圍內(nèi)僅檢出單個(gè)位點(diǎn)雜合突變，則對(duì)SLC26A4基因剩余外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增及Sanger測(cè)序分析。測(cè)序過(guò)程如下：先通過(guò)PCR擴(kuò)增并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析確認(rèn)，PCR產(chǎn)物于SAP酶混合液中純化，再行Cycle測(cè)序反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)NaAc-乙醇法進(jìn)行純化，并在ABI3130 DNA全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用DNAstar軟件讀取測(cè)序數(shù)據(jù)，并用SeqMan軟件將所測(cè)序列與NCBI中的基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析，記錄序列比對(duì)結(jié)果。

2 結(jié)果

187例耳聾患者中有22例患者檢出SLC26A4基因突變，占11.76%；其中SLC26A4雜合突變4例（2.13%），純合或復(fù)合雜合突變18例（9.63%）。22例患者共檢出11種SLC26A4基因分型，包括5例c.919-2A＞G/c.2168A＞G、4例 c.919-2A＞G雜合突變、4例 c.919-2A＞G純合突變、2例c.919-2A＞G/c.416-1G＞A、1例c.919-2A＞G/c.946G＞T、1例 c.919-2A＞G/c.1229C＞T、1例 c.919-2A＞G/c.1607A＞G、1例 c.919-2A＞G/c.1707+5G＞A、1例 c.919-2A＞G/c.1975G＞C、1例 c.919-2A＞G/c.2167C＞G、1例 c.2168A＞G/c.281C＞T，見(jiàn)表1。

22例基因突變患者共檢出SLC26A4基因10種40次突變，其中c.919-2A＞G檢出率最高，占總等位基因的6.68%（25/374）；c.2168A＞G突變6次，占總等位基因的1.60%（6/374）；c.416-1G＞A突變2次，占總等位基因的 0.53%（2/374）；c.281C＞T、c.946G＞T、c.1229C＞T、c.1607A＞G、c.1707+5G＞A、c.1975G＞C、c.2167C＞G各突變1次，分別占總等位基因的0.27%（1/374），見(jiàn)表2。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，溫州地區(qū)187例非綜合性型耳聾患者共檢出22例存在SLC26A4基因突變，占11.76%，其中9.63%存在雙等位基因突變，這與我國(guó)其他地區(qū)報(bào)道的5%～15%的基因突變檢出率相近[5，10-11]。在等位基因突變頻率中，c.919-2A＞G、c.2168A＞G所占比例最高，是溫州地區(qū)非綜合征耳聾患者SLC26A4基因突變最主要的類型，與我國(guó)其他地區(qū)報(bào)道結(jié)果亦相同[5，10-11]。SLC26A4基因是常染色體隱性遺傳，但全編碼區(qū)測(cè)序范圍內(nèi)檢測(cè)仍有4例為單位點(diǎn)雜合突變患者，推測(cè)可能存在基因上游調(diào)控區(qū)的未知點(diǎn)突變或是拷貝數(shù)變異導(dǎo)致復(fù)合雜合致病，亦或是該類個(gè)體僅單純的為人群基因雜合突變攜帶者[5，12]。

表1 SLC26A4基因突變患者基因分型（n=187）

表2 SLC26A4基因突變及其頻率（n=374）

22例基因突變患者共檢出10種致病突變，其中c.281C＞T、c.1229C＞T、c.1607A＞G、c.1975G＞C、c.2167C＞G以及c.2168A＞G為錯(cuò)義突變，分別導(dǎo)致SLC26A4基因編碼蛋白第 94、410、536、659、723、723 位點(diǎn)發(fā)生氨基酸替換；c.946G＞T為無(wú)義突變，導(dǎo)致編碼蛋白發(fā)生提前終止而截短；c.416-1G＞A、c.919-2A＞G、c.1707+5G＞A為剪接突變，導(dǎo)致編碼蛋白的外顯子拼接發(fā)生剪接錯(cuò)誤；上述突變均致使SLC26A4基因編碼產(chǎn)生非正常功能的PDS蛋白，使內(nèi)耳胞間離子交換受阻，最終導(dǎo)致耳聾臨床表型的發(fā)生[13-16]。除了高檢出率的c.919-2A＞G與c.2168A＞G突變外，其余8種罕見(jiàn)突變分別位于基因不同的外顯子或內(nèi)含子上，這表明對(duì)檢出存在熱點(diǎn)位點(diǎn)雜合突變的耳聾患者應(yīng)對(duì)剩余所有的外顯子及與內(nèi)含子交界處片段的位點(diǎn)進(jìn)行突變檢測(cè)，進(jìn)而提高SLC26A4基因突變檢出率。

綜上所述，SLC26A4基因是溫州地區(qū)非綜合型耳聾患者的主要致聾基因之一，c.919-2A＞G、c.2168A＞G是該地區(qū)SLC26A4基因突變最主要的類型，與我國(guó)其他地區(qū)耳聾群體數(shù)據(jù)相似。此外，本研究同時(shí)檢出了多種熱點(diǎn)以外的罕見(jiàn)突變，豐富了溫州地區(qū)耳聾患者的遺傳突變圖譜，為本地區(qū)耳聾患者的基因診斷和遺傳咨詢提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和遺傳學(xué)理論指導(dǎo)。