何京樺， 樂科易

(復旦大學 生命科學學院， 上海 200433)

L-色氨酸在人和動物體內(nèi)非常重要，同時在醫(yī)藥、食品和飼料添加劑等方面具有廣泛的用途[1-4]。大腸桿菌生長迅速、遺傳背景清晰，被認為是生產(chǎn)L-色氨酸的主要菌株。大腸桿菌的tnaA基因編碼色氨酸酶(tryptophanase)，該酶在正常情況下可以將L-色氨酸降解成丙酮酸、吲哚和氨，從而使碳源進入TCA循環(huán)，阻礙L-色氨酸的積累[5-6]。tnaA基因的失活有利于大腸桿菌積累更多的L-色氨酸[7]。

成簇、規(guī)則間隔的短回文重復序列(clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat，CRISPR)是細菌在長期進化過程中產(chǎn)生的抵抗外源基因入侵的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[8-11]。CRISPR-Cas9系統(tǒng)為RNA介導的基因組編輯提供了強大的工具，并已廣泛應(yīng)用于包括原核生物和真核生物在內(nèi)的多種生物中[12-14]。在該系統(tǒng)中，CRISPR RNA(crRNA)通過與轉(zhuǎn)錄激活crRNA(trans-activating RNA，tracrRNA)結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復合物，引導Cas9核酸內(nèi)酶在目的DNA序列生成雙鏈斷裂(double-strand breaks，DSBs)[15-16]。gRNA與靶DNA序列中長約20 bp的片段互補配對，靶序列末端須含有PAM序列(5′-NGG)[17]。

本研究以E.coliw3110-Δ為出發(fā)菌株，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對其tnaA基因進行敲除，篩選出tnaA基因缺失菌株，減少色氨酸的降解，從而為L-色氨酸高產(chǎn)菌株的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

E.coliw3110-Δ由本實驗室保存，特征是酪氨酸缺陷型，適合于芳香族氨基酸發(fā)酵。pCas和pTargetF質(zhì)粒通過Add gene載體庫(http://www.addgene.org/crispr-cas)獲得，編號分別為62225和62226。pTargetF-tnaA質(zhì)粒由本研究構(gòu)建。

1.2 主要試劑

DNA產(chǎn)物純化試劑盒(TIAN quick Mini Purification Kit)購于天根生化科技(北京)有限公司。DNA聚合酶(Prime STAR?Max DNA Polymerase)和限制性內(nèi)切酶DpnI均購于寶生物工程(大連)有限公司。Gibson組裝克隆試劑盒(Gibson Assemly Cloning Kit)購自NEB(北京)有限公司。

1.3 gRNA質(zhì)粒的構(gòu)建

通過http://www.rgenome.net/cas-offinder/設(shè)計tnaA基因的gRNA。將設(shè)計出的20 bp序列加入引物gRNAR中。用一步等溫Gibson組裝法利用Prime STAR?Max DNA 聚合酶將pTargetF、上下游引物gRNA F、gRNA R進行組裝[18]。將獲得的產(chǎn)物用DpnI酶切，以去除多余的pTargetF。獲得的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，小提質(zhì)粒，用測序引物gRNAP F/gRNAP R測序鑒定。將構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為pTargetF-tnaA。本研究所用引物和gRNA寡核苷酸序列見表1。

表1 gRNA和引物

1.4 tnaA基因同源修復供體 DNA的構(gòu)建

以E.coliw3110-Δ基因組DNA為模板，tnaA L F、tnaA L R為引物，PCR擴增獲得片段1，以tnaA R F、tnaA R R為引物，PCR擴增獲得片段2。以AmlF和AmlR為引物，將片段1和片段2用重疊延伸PCR法獲得同源修復供體DNA。

1.5 感受態(tài)細胞的制備及細菌的轉(zhuǎn)化

將pCas質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliw3110-Δ感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布到含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB瓊脂上(30 ℃培養(yǎng))，挑選獲得含有pCas質(zhì)粒的E.coliw3110-Δ。將含有pCas質(zhì)粒的E.coliw3110-Δ按照文獻[14]描述的方法制備感受態(tài)細胞。當感受態(tài)細胞生長至其OD600為0.1時，加入終濃度為10 mmol/L的阿拉伯糖，以誘導λ-Red介導的同源重組[19]。當OD600=0.6時收集菌體，將100 ng gRNA質(zhì)粒pTargetF-tnaA和500 ng供體DNA加入到約100 μL含pCas質(zhì)粒的E.coliw3110-Δ感受態(tài)細胞中，進行電轉(zhuǎn)(2 mm cuvette, 2.5 kV)。電轉(zhuǎn)后立即在1 mL LB液體培養(yǎng)基中懸浮細胞，30 ℃復蘇1 h，涂布至含有卡那霉素(50 μg/mL)和壯觀霉素(50 μg/mL)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。30 ℃過夜培養(yǎng)，用引物tnaAP F和tnaAP R對轉(zhuǎn)化子進行PCR檢測，并進行測序鑒定，將測序結(jié)果和原基因序列進行對比，檢測tnaA基因是否敲除成功。

1.6 pTargetF-tnaA和pCas的消除

將鑒定正確的含有pCas和pTargetF-tnaA的克隆接種于含有卡那霉素(50 μg/mL)和IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，0.5 mmol/L)的2 mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8到16 h后涂布到含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB瓊脂上。然后以克隆對壯觀霉素(50 μg/mL)的敏感性確認pTargetF-tnaA已經(jīng)被消除。將克隆在43 ℃培養(yǎng)過夜以消除pCas質(zhì)粒[20]。

1.7 敲除效率的優(yōu)化及檢測

為提高該敲除系統(tǒng)對大腸桿菌tnaA基因的敲除效率，在100 μL感受態(tài)細胞中，將pTargetF-tnaA質(zhì)粒加入量由普遍采用的100 ng提高到300 ng, 供體DNA片段加入量由普遍采用的400 ng提高到1.5 μg進行轉(zhuǎn)化，用引物tnaAP F和tnaAP R對轉(zhuǎn)化子進行PCR鑒定和測序鑒定，計算該系統(tǒng)對tnaA的敲除效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 gRNA的構(gòu)建

用一步等溫Gibson組裝法利用Prime STAR?Max DNA 聚合酶將pTargetF質(zhì)粒、上下游引物進行組裝。獲得的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，小提質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒pTargetF-tnaA送檢測序，測序結(jié)果正確，可用于下一步試驗。

2.2 tnaA基因同源修復供體 DNA的構(gòu)建

分別以tnaA L F/R 和tnaARF/R為引物，PCR擴增獲得了片段1和片段2，以AmlF和AmlR為引物，利用片段1和片段2用重疊延伸PCR法獲得了同源修復供體 DNA。

2.3 tnaA基因的敲除及敲除效率的檢測

pCas質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入E.coliw3110-Δ中。pTargetF-tnaA質(zhì)粒和供體DNA成功共轉(zhuǎn)入含有pCas質(zhì)粒的E.coliw3110-Δ中。用橫跨tnaA基因同源修復供體DNA的鑒定引物tnaAP F和tnaAP R擴增目的條帶來鑒定tnaA基因的敲除情況。結(jié)果(圖1)顯示，tnaA基因沒被敲除修復的菌，PCR顯示為1150 bp的條帶，反之出現(xiàn)750 bp的目的條帶。測序結(jié)果與設(shè)計的同源臂序列是一致的，表明敲除后的tnaA基因在人工設(shè)計的供體序列下發(fā)生了同源修復。挑取12個克隆進行PCR鑒定和測序鑒定，9個克隆敲除成功，該敲除系統(tǒng)對大腸桿菌tnaA的敲除效率為75%。以上結(jié)果均表明，本研究構(gòu)建的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在人工同源修復下，可對大腸桿菌tnaA基因進行高效敲除,圖2是敲除模式示意圖。

M：相對分子質(zhì)量；0：原始菌的PCR產(chǎn)物；泳道4、9、10：未敲除成功的PCR產(chǎn)物，大小約為1150 bp；泳道1、2、3、5、6、7、8、11和12：敲除tnaA后的PCR產(chǎn)物，大小約為750 bp

圖2 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因敲除示意圖

3 討論與結(jié)論

CRISPR-Cas9是細菌以及古細菌在長期進化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫機制，用以對抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，則是對目的基因進行特定的DNA修飾的技術(shù)，該技術(shù)已應(yīng)用于細菌、真菌、斑馬魚以及人類細胞的基因編輯。

在該技術(shù)中，一般是將CRISPR-Cas9技術(shù)與同源重組技術(shù)結(jié)合起來，構(gòu)建含Cas9、sgRNA和Donor序列的重組載體，對目標基因進行有效準確的編輯。當然該技術(shù)也在不斷地被改進優(yōu)化， Jiang等人在Cas9質(zhì)粒構(gòu)建時引入了Red重組系統(tǒng)，供體DNA序列不需要克隆到載體上，而是直接與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入宿主菌，使得該技術(shù)可以對多個基因同時進行高效的敲除[14]。

為了避免雙鏈斷裂DNA被同源修復后，gRNA/Cas9復合體對其重復切割，Wang等人采用了兩步法策略，第一步使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)用20 bp人工序列替換了原始間隔序列，以避免gRNA/Cas9復合體的重復切割；第二步使用第二個gRNA識別引入的人工序列進行基因突變，同時人工序列被還原為原始序列，從而只引入一個點突變，且不會改變PAM或不會在基因組中插入額外的沉默突變[20]。

本研究在構(gòu)建質(zhì)粒時采用了Gibson等溫一步拼接法，該方法是目前最常用的新興克隆方法之一, 能在5′核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶的協(xié)同作用下直接組裝多個重疊DNA分子，這種組裝方法可以無縫地構(gòu)建基因, 是一種有用的分子工程工具。

本研究成功構(gòu)建了大腸桿菌tnaA基因CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)，敲除效率75%。該系統(tǒng)將來也可應(yīng)用于大腸桿菌其他基因的敲除，為構(gòu)建L-色氨酸高產(chǎn)大腸桿菌提供有效的基因敲除工具。