柯美蘭， 吳 杭， 張部昌

(1. 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院; 2. 安徽大學(xué) 物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院， 合肥 230601)

亮氨酸應(yīng)答調(diào)控蛋白(Leucine responsive regulatory protein, Lrp)廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌中，如常見的大腸桿菌、惡臭假單胞菌和一些致病性病原菌(創(chuàng)傷弧菌)等；放線菌中的谷氨酸棒狀桿菌、結(jié)核分枝桿菌和抗生素產(chǎn)生菌等；古生菌中的嗜熱菌、硫化葉菌、甲烷球菌和嗜鹽菌等。截至目前，已報(bào)道的Lrp情況見表1。在現(xiàn)有真核生物基因組中，沒有發(fā)現(xiàn)Lrp同源蛋白[1]。

大腸桿菌Lrp(EcoLrp)能夠調(diào)控體內(nèi)大約400多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，既能正調(diào)控涉及氨基酸生物合成、菌毛生物合成和氨同化的操縱子，也可以負(fù)調(diào)控參與氨基酸分解代謝和肽轉(zhuǎn)運(yùn)[2]。大腸桿菌的天冬酰胺合成酶C(Asparagine synthetase C, AsnC)蛋白通過激活臨近天冬酰胺合成酶A基因(asnA)的轉(zhuǎn)錄和自我調(diào)節(jié)調(diào)控體內(nèi)天冬酰胺的生物合成。天冬酰胺的存在可以消除這種激活作用，但并不影響AsnC的自我調(diào)節(jié)[3]。因兩者是同源的調(diào)控蛋白，且已有文獻(xiàn)將Lrp和AsnC蛋白放在一起描述，故又稱為Lrp/AsnC家族調(diào)控因子[4]。Lrp既可作為全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[2]，也可發(fā)揮局部調(diào)控作用[3]。Lrp還能作為富足/饑餓調(diào)控蛋白[5-6]，根據(jù)環(huán)境中營養(yǎng)的豐度調(diào)節(jié)氨基酸的代謝。當(dāng)環(huán)境中營養(yǎng)豐富時(shí)，Lrp能降低氨基酸的合成；當(dāng)處于營養(yǎng)貧乏的環(huán)境時(shí)，能夠刺激氨基酸的合成[2]。

隨著研究者對(duì)各族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子研究的進(jìn)一步加深，Lrp家族得到了更多關(guān)注。本文綜述了 Lrp家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的研究進(jìn)展，以期能夠?yàn)楹罄m(xù)研究Lrp提供參考。

表1 已報(bào)道Lrp的分布情況

1 基本結(jié)構(gòu)特征

Lrp蛋白單體分子量在15～18 ku之間，主要由N末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C末端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成(如圖1)[30]。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠特異性識(shí)別并結(jié)合靶DNA，包含保守的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)結(jié)構(gòu)。通過基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)古生菌中通過結(jié)合DNA來影響基因表達(dá)的調(diào)控蛋白大多都具有HTH結(jié)構(gòu)，而且類似細(xì)菌中HTH的結(jié)構(gòu)基序[31]。配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，也稱為氨基酸代謝調(diào)控(Regulation of amino acid metabolism，RAM)結(jié)構(gòu)域，可響應(yīng)配體氨基酸。RAM結(jié)構(gòu)域是典型的αβ-三明治結(jié)構(gòu)，可以促進(jìn)配體結(jié)合和蛋白寡聚化[5-6, 22, 32]。Lrp蛋白最小的功能結(jié)構(gòu)單元是二聚體。兩個(gè)單體蛋白C末端結(jié)構(gòu)域的β鏈相互作用，形成具有一個(gè)穩(wěn)定疏水中心的二聚體蛋白，進(jìn)而形成四聚體、六聚體、八聚體或十六聚體(如圖1)[33]。盡管Lrp同源蛋白之間的氨基酸序列相似性很低，但在已知Lrp晶體結(jié)構(gòu)中，存在保守性的空間結(jié)構(gòu)[13, 34]。

2 配體以及應(yīng)答方式

2.1 Lrp的配體

最早發(fā)現(xiàn)EcoLrp的配體是Leu[7, 35]和應(yīng)答程度較小的Ala[36-37]。隨后發(fā)現(xiàn)Lrp還能應(yīng)答Arg、Gln、His、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr、Val、Asp、Ile、Glu等氨基酸[19](見表2)。結(jié)核分枝桿菌RV3291c可響應(yīng)Leu、Met、Ile、His和Thr[38]。腦膜炎奈瑟球菌NMB0573可應(yīng)答Leu和Met[11]。嗜鹽桿菌LrpA1僅應(yīng)答Asp[27]。古細(xì)菌中只有RAM結(jié)構(gòu)域的DM1蛋白被證實(shí)除了對(duì)氨基酸響應(yīng)外還能與2-酮戊二酸結(jié)合[5]。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)Lys和Arg可以降低糖多孢紅霉菌Lrp(SACE_Lrp)對(duì)靶DNA的結(jié)合親和力，而His則增強(qiáng)。這表明SACE_Lrp 可以通過響應(yīng)氨基酸調(diào)節(jié)蛋白對(duì)DNA的結(jié)合活性[18]，這是首次被解析可以雙向響應(yīng)配體的Lrp。最近發(fā)現(xiàn)小分子維生素B1、B3、B6、VC 等和四氫喹啉衍生物也可以作為Lrp的配體[14, 39]。

A：單體 Monomer; B：二聚體 Dimer; C：四聚體 Tetramer; D：八聚體Octamer

圖1 Lrp蛋白的結(jié)構(gòu)[14]

Figure 1 Structure of Lrp protein

表2 Lrp應(yīng)答不同種類的配體小分子

2.2 Lrp應(yīng)答配體的方式

配體結(jié)合會(huì)導(dǎo)致Lrp蛋白構(gòu)象變化[40]。Lrp在存在效應(yīng)分子時(shí)，會(huì)通過結(jié)構(gòu)微調(diào)來調(diào)節(jié)其DNA結(jié)合活性，從而將信號(hào)轉(zhuǎn)化成應(yīng)答[38]。目前有3種變化方式：

1)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域附近微妙變化[41]。氨基酸結(jié)合改變了DNA結(jié)合域的相對(duì)空間分布，從而破壞了蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物[14]。

O1-O4為MtbAldR靶位點(diǎn)；兩個(gè)相鄰靶位點(diǎn)之間的數(shù)字表示位點(diǎn)序列中心T核苷酸(序列未列出)之間的距離

圖2“開放”和“封閉”的八聚體MtbAldR結(jié)合ald基因上游的多個(gè)靶位點(diǎn)[14]

Figure 2 “Open”and “closed” octamer MtbAldR binding to multiple target sites upstream ofaldgene

2)蛋白構(gòu)象變化[14, 20]?！胺忾]”的四級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)DNA結(jié)合域的調(diào)整或改變較小，而“開放”的結(jié)構(gòu)可以使它們能夠結(jié)合到更多(20-40)堿基分隔的靶DNA位點(diǎn)上。如FL11與Lys結(jié)合時(shí)，形成一個(gè)“封閉”的八聚體，而與Arg結(jié)合，能使八聚體變成開環(huán)構(gòu)象[20]；Dey等發(fā)現(xiàn)MtbAldR的洗脫液中存在Ala、Asp和Phe時(shí)，蛋白質(zhì)的洗脫峰會(huì)出現(xiàn)輕微左移，推測是因?yàn)樾?yīng)分子使蛋白出現(xiàn)“開放”或者“閉合”的結(jié)構(gòu)[14]。在透射電子顯微鏡下觀察到MtbAldR在Ala存在的情況下采用“開放”的四級(jí)結(jié)構(gòu)，推測可能是因?yàn)閍ld基因上游存在多個(gè)靶位點(diǎn)需要蛋白結(jié)合[14](如圖2)。

3)蛋白寡聚體形式變化[5-6, 22, 32]。如EcoLrp與Leu結(jié)合使其從十六聚體轉(zhuǎn)變成八聚體[35]；Dey等還發(fā)現(xiàn)MtbAldR的蛋白洗脫液中含有不同濃度的Ala時(shí)，MtbAldR以六聚體、七聚體、八聚體和十聚體等形式被洗脫下來[14]。

3 調(diào)控機(jī)制

Lrp蛋白既可以正調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，也可以負(fù)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，甚至可以發(fā)揮雙重地激活或者抑制作用[2, 30, 42]。如硫磺礦硫化葉菌Ss-LrpB依據(jù)蛋白濃度雙重調(diào)節(jié)自身基因的轉(zhuǎn)錄，低濃度時(shí)促進(jìn)基因的表達(dá)，高蛋白濃度則會(huì)抑制自身基因的轉(zhuǎn)錄[25, 43]。

根據(jù)已有的研究報(bào)道，Lrp調(diào)控機(jī)制總結(jié)為兩種。1)通過DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合并調(diào)控靶基因；2)與其他調(diào)控因子或蛋白協(xié)同發(fā)揮調(diào)控作用。

大多數(shù)細(xì)菌Lrp通過直接與靶基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[11]。古細(xì)菌Lrp家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雖與細(xì)菌相似，但其轉(zhuǎn)錄機(jī)制卻類似真核生物[31]，基因的轉(zhuǎn)錄起始需要轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物(TATA結(jié)合蛋白和其他轉(zhuǎn)錄因子)協(xié)同RNA聚合酶[44]，所以古生菌中Lrp蛋白發(fā)揮調(diào)控作用不是直接由蛋白結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)而實(shí)現(xiàn)的。嗜熱古生菌的LrpA可以與TATA盒的下游序列結(jié)合，通過空間位阻阻斷RNA聚合酶結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，導(dǎo)致其無法正常地起始轉(zhuǎn)錄[25, 45]。硫磺礦硫化葉菌中的Lrs14也是通過空間位阻效應(yīng)阻斷TATA結(jié)合蛋白(TATA-binding protein, TBP)、轉(zhuǎn)錄因子B(Transcription factor B, TFB)與TATA盒(TATA box)、B因子識(shí)別元件(Factor B recognition element, BRE)結(jié)合，從而發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用[25-26]。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)EcoLrp可以與其他全局性調(diào)控因子，如cAMP受體蛋白、整合宿主因子、組蛋白樣蛋白H-NS等，通過蛋白互作共同發(fā)揮調(diào)控作用[1]。有趣的是，嗜鹽桿菌中兩個(gè)Lrp可能選擇類似細(xì)菌中不同的sigma因子輔助調(diào)控不同的啟動(dòng)子[27]，如Lrp 激活tfbF，LrpA1 抑制tfbB。

4 調(diào)控功能

早期研究發(fā)現(xiàn)Lrp參與調(diào)控氨基酸的代謝，隨著研究進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)Lrp還可調(diào)控菌毛生成、抗生素的生物合成、重金屬和多肽的轉(zhuǎn)運(yùn)、ATP代謝等其他生理過程，具有多樣化的調(diào)控功能。新的研究發(fā)現(xiàn)Lrp還可調(diào)控致病菌的毒性強(qiáng)弱。以下主要介紹細(xì)菌與古生菌中Lrp的多種生物學(xué)功能。

4.1 Lrp在細(xì)菌中的調(diào)控功能

起初，Anderson等發(fā)現(xiàn)EcoLrp蛋白能夠影響分支氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)[46]。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)EcoLrp不僅能影響氨基酸代謝，還能影響菌毛生成[1]。惡臭假單胞菌Lrp家族同源蛋白BkdR(與EcoLrp有36.5%的氨基酸同源性)通過正向調(diào)控bkd操縱子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)增強(qiáng)BkdR對(duì)胰蛋白酶的敏感性[47]。將EcoLrp導(dǎo)入bkdR缺失突變株時(shí)，BkdR功能恢復(fù)，這暗示著BkdR與EcoLrp調(diào)控功能的互補(bǔ)性[8]。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)SACE_Lrp與天藍(lán)色鏈霉菌中Lrp蛋白SCO3361也可以蛋白互作[16, 18]。近期發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌的Lrp作為全局調(diào)控因子正向調(diào)控細(xì)菌細(xì)胞毒力、趨化性和鐵離子獲取能力。Lrp可以結(jié)合在7個(gè)毒力相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)并發(fā)揮正調(diào)控作用，但本身進(jìn)行負(fù)向自我調(diào)節(jié)。當(dāng)lrp突變后，突變株中與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)、蜂毒肽合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平被下調(diào)，與細(xì)胞毒素分泌、趨化性相關(guān)的基因水平都顯著降低[9]。嗜線蟲致病桿菌中全局性調(diào)控子Lrp蛋白的豐度會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的毒力發(fā)生變化[10]。

近年來，放線菌Lrp也得到較多的關(guān)注。谷氨酸棒狀桿菌Lrp通過激活轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BrnFE的表達(dá)提高L-異亮氨酸的產(chǎn)量[12, 48]。結(jié)核分枝桿菌LrpA(RV3291c) 可以幫助細(xì)菌抵抗?fàn)I養(yǎng)貧乏等不利的環(huán)境。當(dāng)營養(yǎng)不足時(shí)，lrpA的轉(zhuǎn)錄水平升高，且LrpA會(huì)直接結(jié)合其上游編碼賴氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因lat的啟動(dòng)子區(qū)，促進(jìn)lat轉(zhuǎn)錄[13]。MtbAldR(RV2779c)也具有同樣的調(diào)控作用，直接結(jié)合其上游編碼丙氨酸脫氫酶的靶基因(ald)。在缺乏營養(yǎng)的條件下，ald的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)高度上調(diào)[14]。天藍(lán)色鏈霉菌中Lrp蛋白BkdR可以調(diào)控相鄰bkd操縱子的表達(dá)。當(dāng)bkd突變后，菌株會(huì)存在產(chǎn)孢缺陷并且失去有關(guān)色素的表達(dá)能力，致使孢子數(shù)量減少、活力降低并且放線紫紅素的產(chǎn)量明顯下降[49]。Yu等還發(fā)現(xiàn)天藍(lán)色鏈霉菌中Lrp同源蛋白SCO2140可以正向調(diào)控放線紫紅素和鈣依賴抗生素的生物合成。SCO2140缺失突變后，孢子形成時(shí)間會(huì)延遲，而SCO2140蛋白缺乏DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其作用靶點(diǎn)并不清楚[15]。

本實(shí)驗(yàn)室在Lrp對(duì)抗生素生物合成的基因調(diào)控研究領(lǐng)域取得重要進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)SACE_Lrp通過調(diào)控分支氨基酸(Leu，Ile和Val)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，負(fù)向影響紅霉素生物合成。這是首次在產(chǎn)抗生素放線菌中解析Lrp對(duì)抗生素生物合成調(diào)控機(jī)制的研究[18]。此后我們還發(fā)現(xiàn)天藍(lán)色鏈霉菌SCO3361通過直接調(diào)控actII-ORF4(編碼放線紫紅素生物合成基因簇內(nèi)調(diào)控蛋白)和amfC(編碼氣生菌絲形成蛋白)的轉(zhuǎn)錄水平，正向影響放線紫紅素的生物合成和菌株的形態(tài)分化[16]。最近，Lu等又發(fā)現(xiàn)螺旋霉素鏈霉菌中的Orf2(SSP_Lrp)是一個(gè)全局性調(diào)控因子，通過控制(雙)螺旋霉素生物合成基因簇內(nèi)正調(diào)控基因bsm23、bsm42和acyB2的轉(zhuǎn)錄水平，負(fù)調(diào)控(雙)螺旋霉素的生物合成[17]。

4.2 Lrp在古生菌中的調(diào)控功能

Lrp/AsnC家族是古生菌中4個(gè)廣泛存在并且數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白家族之一[31]，其余3個(gè)調(diào)控家族分別為：HTH_3(假定激活蛋白家族)、TrmB(麥芽糖特異性調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白)和ArsR(解毒過程相關(guān)蛋白)。目前古生菌中Lrp的研究主要集中在4個(gè)模式菌株：嗜熱菌、硫化葉菌、甲烷球菌和嗜鹽菌[19]。

古生菌Lrp不僅能調(diào)節(jié)氨基酸代謝，還可影響中心代謝、ATP代謝、重金屬多肽等物質(zhì)運(yùn)輸。堀崎嗜熱球菌Lrp家族蛋白FL11可應(yīng)答Lys[20]，還可以作為“富足或饑餓”調(diào)節(jié)因子調(diào)控細(xì)胞的生長狀態(tài)[6]。當(dāng)營養(yǎng)富足時(shí)，氨基酸分解代謝并且ATP合成處于激活去阻遏狀態(tài)，細(xì)胞生長；當(dāng)營養(yǎng)貧乏時(shí)，氨基酸生物合成基因被激活，細(xì)胞停止生長[6]。嗜鹽桿菌Lrp通過激活korAB(編碼氧戊二酸鐵氧還蛋白氧化還原酶)影響氧戊二酸和谷氨酸的平衡控制TCA循環(huán)的方向和速率，進(jìn)而參與調(diào)控中心代謝[27]；可正調(diào)控編碼谷氨酰胺合成酶的glnA、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子sirR和負(fù)調(diào)控甘油脫氫酶基因gldA1及轉(zhuǎn)導(dǎo)基因car；還可以刺激磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子pstC2和phnC的表達(dá)[27]。另一Lrp蛋白(LrpA1)依賴L-天冬氨酸特異性地負(fù)向調(diào)節(jié)編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的aspb3基因，但正向調(diào)節(jié)自身基因的轉(zhuǎn)錄水平。詹氏甲烷球菌Ptr2通過二級(jí)上游激活位點(diǎn)(UAS)向TATA盒募集TBP增強(qiáng)紅素氧還蛋白R(shí)b2和鐵氧還蛋白FdxA的表達(dá)[25, 28]。來自硫磺礦硫化葉菌的Ss-LrpB可正向激活丙酮酸鐵氧化還原酶操縱子porDAB和兩個(gè)滲透酶基因表達(dá)，這初步鑒定了Ss-LrpB蛋白的體內(nèi)生理作用[25, 32]。嗜酸熱硫化葉菌BarR激活參與β-Ala降解的β-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因表達(dá)，也激活編碼谷氨酰胺合成酶基因的轉(zhuǎn)錄[29]。

古生菌中一些Lrp蛋白不僅可以調(diào)節(jié)本家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達(dá)，還可以調(diào)控其他家族調(diào)控子的表達(dá)，暗示著其中可能存在分級(jí)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[19, 27]。如堀崎嗜熱球菌的全局性調(diào)控因子FL11可以影響至少其他4個(gè)Lrp蛋白的表達(dá)[19-20]。

5 展望

近年來，Lrp受到越來越多地關(guān)注，但相對(duì)其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白家族的研究，如TetR、LuxR和MarR等[50]，其研究還是較少。大腸桿菌Lrp的結(jié)構(gòu)和功能已研究得較為透徹，這對(duì)理解來自不同種屬Lrp的調(diào)控功能具有指導(dǎo)意義。然而，仍有許多問題亟待解決。例如：尚未有文章詳細(xì)介紹Lrp N末端的保守氨基酸如何識(shí)別不同的結(jié)合位點(diǎn)，這對(duì)研究Lrp如何發(fā)揮調(diào)控作用具有重要意義；古生菌中Lrp靶基因和效應(yīng)分子仍缺乏認(rèn)識(shí)，其分級(jí)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不清楚；古菌中DM1蛋白和天藍(lán)色鏈霉菌中SCO2140蛋白缺乏DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其是怎樣發(fā)揮調(diào)控作用并不清楚；目前僅有一篇報(bào)道從結(jié)構(gòu)上解釋了氨基酸(僅Ala)如何影響Lrp(MtbAldR)的DNA結(jié)合活性。這為后續(xù)研究其他Lrp如何應(yīng)答氨基酸提供依據(jù)。文章還提出，不同配體的結(jié)合是否會(huì)引起蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)細(xì)微的變化而形成不同程度“開放”，不同四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白與靶位點(diǎn)結(jié)合是否引發(fā)不同的應(yīng)答，都需要進(jìn)一步研究。此外，本實(shí)驗(yàn)室解析了Lrp參與調(diào)控抗生素生物合成的分子機(jī)制[16, 18]，這為研究其他產(chǎn)抗生素放線菌中的Lrp指明了方向[17]。