李曉麗，馮龍，陳瑜，李勇

（泗陽(yáng)縣水產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 泗陽(yáng) 223700）

近年來(lái)，泗陽(yáng)縣水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，但每年細(xì)菌性病害對(duì)我縣水產(chǎn)養(yǎng)殖都會(huì)造成一定的損失，給廣大養(yǎng)殖戶帶來(lái)了一定的經(jīng)濟(jì)損失，甚至極少數(shù)養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖全軍覆沒(méi)，損失慘重，嚴(yán)重打擊了養(yǎng)殖戶的積極性。對(duì)病原菌的分離、鑒定和藥物敏感性實(shí)驗(yàn)可有效的防止藥物的濫用和誤用。

為了指導(dǎo)轄區(qū)各漁場(chǎng)防控細(xì)菌性病害并科學(xué)選擇和實(shí)驗(yàn)水產(chǎn)藥物，2018年4月至11月，泗陽(yáng)縣水生動(dòng)物疫病防控中心對(duì)縣域內(nèi)水產(chǎn)主要養(yǎng)殖品種進(jìn)行了疫病監(jiān)測(cè)，并對(duì)其感染致病性菌株進(jìn)行了形態(tài)、生理生化特征、藥物敏感性試驗(yàn)等研究，以期為泗陽(yáng)縣水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的病原和防控提供科學(xué)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

來(lái)自泗陽(yáng)縣盧集鎮(zhèn)、穿城鎮(zhèn)、三莊鄉(xiāng)、史集街道辦、城廂街道辦、愛(ài)園鎮(zhèn)等漁場(chǎng)的多個(gè)發(fā)病養(yǎng)殖塘口，采集活力差、表皮充血、黑頭、溜邊等瀕臨死亡的水產(chǎn)樣品。

營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、TCBS瓊脂、脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂購(gòu)于北京路橋。氧化酶試劑盒購(gòu)于杭州某公司，腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）（英文名API 20E）購(gòu)于上海某公司，動(dòng)物用藥敏分析試劑板購(gòu)于南京某醫(yī)療科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的分離純化 樣品先用酒精棉擦拭，用滅菌的鑷子和剪刀取適量病變組織、內(nèi)臟、血液、鰓等放于營(yíng)養(yǎng)湯，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。在無(wú)菌條件下，用滅菌的接種環(huán)取培養(yǎng)液劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。觀察菌落形態(tài)，并挑取可疑單個(gè)菌落劃線接種在TCBS培養(yǎng)基和脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，分別置于37℃和28℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。

1.2.2 API試劑條微生物鑒定 用滅菌吸管挑取單個(gè)菌落至0.85%的NaCl中制成菌液，將5 mL無(wú)菌水放進(jìn)培養(yǎng)盒里，將試劑條放進(jìn)培養(yǎng)盒內(nèi)，將菌液接種到小管或者小管及小杯（CIT，VP和GEL），利用礦物油覆蓋制定的生化孔（有劃線的孔）ADH、ODC、H2S和URE。蓋上培養(yǎng)盒，于35～37℃孵育18～24h，同時(shí)做氧化酶試驗(yàn)構(gòu)成第21個(gè)試驗(yàn)。孵育后根據(jù)判讀表判斷個(gè)反應(yīng)結(jié)果，參照生化譜手冊(cè)，得到鑒定結(jié)果，同時(shí)參照NCCLs和CLSI標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥物的敏感性及耐藥性進(jìn)行判斷。

1.2.3 病原菌的藥敏試驗(yàn) 該試驗(yàn)分別對(duì)30株致病性嗜水氣單胞菌、3株副溶血弧菌和3株氣味沙雷氏菌進(jìn)行了抗菌素感受性試驗(yàn)。試驗(yàn)步驟如下：挑取純化后的單個(gè)菌落于5 mL生理鹽水中，制成0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊木鷳乙褐瞥葾管；取2支10 mL的無(wú)菌生理鹽水，打開任意一瓶，以無(wú)菌的方式向陰性對(duì)照孔分別加入200 μL的無(wú)菌生理鹽水；從A管中吸取200 μL菌懸液加入到打開的10 mL無(wú)菌生理鹽水中制成B管。將B管所有菌液倒入到經(jīng)滅菌的V形槽中，再將另一支10 mL無(wú)菌生理鹽水倒入V形槽中?；炀螅梦⒘恳埔浩魑形槽中的菌液加入到所有微孔中（陰性對(duì)照除外）200 μL；將加樣好的藥敏分析試劑板放入28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～28 h，經(jīng)肉眼觀察證實(shí)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)試管中的最低藥物濃度，孔內(nèi)液體渾濁為陽(yáng)性（+），孔內(nèi)液體澄清為陰性（-），最低藥物濃度即藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

表1 病原微生物檢測(cè)采樣品種和數(shù)量匯總表

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 具體的采樣地點(diǎn)、品種和數(shù)量

2018年4—11月在全縣的13個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)塘口抽檢76個(gè)樣品，其中河蟹31個(gè)，草魚29個(gè)，鯽魚11個(gè)，小龍蝦5個(gè)。如表1所示。

2.2 病原菌的分離及形態(tài)特征觀察

分離的出的細(xì)菌在基礎(chǔ)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂上為光滑、濕潤(rùn)、微凸、無(wú)色或淡黃色菌落，在大部分脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂平板上，菌落周圍出現(xiàn)明顯的、透明的蛋白溶蛋白圈，在TCBS上成圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落。

2.3 API試劑條微生物鑒定結(jié)果

試驗(yàn)分離出60個(gè)細(xì)菌分離株，陽(yáng)性檢測(cè)率78.95%。分別確定嗜水氣單胞菌45株，占陽(yáng)性檢出率的75%，副溶血弧菌3株，占陽(yáng)性檢出率的5%，氣味沙雷細(xì)菌4株，占陽(yáng)性檢出率的6.67%，如表2所示。還有未在表中列出的草魚中檢測(cè)出的土生拉烏爾菌、紫色色桿菌、腦膜膿毒性金黃桿菌各1株，河蟹中檢出的阪崎腸桿菌、創(chuàng)傷弧菌、枸櫞酸桿菌、布式檸檬酸桿菌、霍式格里蒙菌各1株，16株未知菌株。

30株致病性嗜水氣單胞菌、3株副溶血弧菌和3株氣味沙雷氏菌對(duì)8種抗菌藥物的感受性性測(cè)定結(jié)果分別如表3、表4和表5所示。

表2 常見的水產(chǎn)病原細(xì)菌陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果匯總表

3 討論與分析

試驗(yàn)用30株致病性嗜水氣單胞菌、3株副溶血弧菌和3株氣味沙雷氏菌對(duì)8種抗菌藥物進(jìn)行敏感性測(cè)定，對(duì)水產(chǎn)選用抗生素具有一定的參考價(jià)值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，采樣分離到的的病原菌對(duì)不同抗菌素藥物表現(xiàn)出了不同度的感受性和耐藥性。30株嗜水氣單胞菌對(duì)硫酸新霉素最敏感，敏感菌株率為100%，其次對(duì)氟苯尼考、乳酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星和強(qiáng)力霉素敏感菌株率分別為96.7%、93.3%、90%和83.3%。但對(duì)紅霉素最不敏感，耐藥菌株率達(dá)93.3%，其次是甲砜霉素，耐藥菌株率達(dá)83.3%。因此，建議在該區(qū)域內(nèi)對(duì)嗜水氣單胞菌引發(fā)的疫病首選硫酸新霉素、氟苯尼考、乳酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星和強(qiáng)力霉素。

表3 30株致病性嗜水氣單胞菌對(duì)抗菌素感受性

表4 3株副溶血弧菌對(duì)抗菌素感受性

表5 3株氣味沙雷氏菌對(duì)抗菌素感受性

3株副溶血弧菌均分離于河蟹肝胰腺中，說(shuō)明副溶血弧菌主要感染河蟹，通過(guò)藥物感受性結(jié)果來(lái)看，該菌對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、氟苯尼考、乳酸環(huán)丙沙星、鹽酸土霉素和強(qiáng)力霉素都敏感，敏感率達(dá)100%。通過(guò)流行性病學(xué)調(diào)查分析，這與當(dāng)?shù)爻尚佛B(yǎng)殖過(guò)程中較少使用抗菌藥物相關(guān)聯(lián)，當(dāng)?shù)爻尚穼?duì)大多數(shù)抗菌藥物有較好的敏感性。而對(duì)甲砜霉素耐藥菌株達(dá)100%，經(jīng)過(guò)調(diào)查，這可能是由于當(dāng)?shù)厥畮准茵B(yǎng)蟹戶曾從同一苗種場(chǎng)購(gòu)買扣蟹，而該苗種場(chǎng)被調(diào)查出多次使用甲砜霉素全池潑灑漂苗有關(guān)。對(duì)紅霉素的耐藥菌株達(dá)66.7%，經(jīng)調(diào)查，這些塘口都有次數(shù)不等地使用過(guò)含紅霉素成分的藍(lán)藻藥殺藍(lán)藻的經(jīng)歷，造成了菌株對(duì)紅霉素產(chǎn)生耐藥性。

在草魚、龍蝦和螃蟹中均分離出氣味沙雷氏菌，該菌是一種廣譜菌。藥物感受性實(shí)驗(yàn)得出，該菌對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、乳酸環(huán)丙沙星敏感菌株達(dá)100%，對(duì)紅霉素不敏感，耐藥性達(dá)100%，其次是甲砜霉素也不敏感，耐藥菌株達(dá)66.7%。這可能與使用過(guò)含紅霉素成分的藍(lán)藻藥殺藍(lán)藻的經(jīng)歷有關(guān)。

綜上所述，泗陽(yáng)縣水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中使用抗生素的現(xiàn)象較少，對(duì)大多說(shuō)抗生素藥物均表現(xiàn)出較高的敏感性。