曾凡鵬，胡 光，羅麗梅，吳翔宇，鄭一敏

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

川芎嗪(ligustrazine,Lig)是從藥材川芎(RhizomaChuanxiong)中分離提純出的生物堿單體[1]。川芎嗪具有抑制血管平滑肌痙攣、改善心肌缺血、抑制血小板聚集、改善血液流變性[2-5]及抗自由基等特點(diǎn)，作為天然活性成分在藥物設(shè)計(jì)合成中被廣泛應(yīng)用[6-10]，臨床上主要用于缺血性心腦血管疾病的治療[11-13]?，F(xiàn)有臨床上治療心腦血管疾病藥物，往往會(huì)造成出血副作用大、耐藥、代謝快等缺點(diǎn)[14-15]。

陳鴻飛等[16]報(bào)道川芎嗪衍生物合成條件為K2CO3堿性環(huán)境，60 ℃、6 h，使用甲苯進(jìn)行減壓蒸餾除去DMF，乙酸乙酯與水進(jìn)行萃取分離有機(jī)相，產(chǎn)率為60%左右，同時(shí)在中間體的制備過程中使用二氯亞砜鹵代反應(yīng)，該方法反應(yīng)劇烈且試劑較刺激，但未見文獻(xiàn)報(bào)川芎嗪氨類衍生物抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)。

本研究以川芎嗪為先導(dǎo)化合物，采用溴代鹵化法制備中間體，使用NaH作為堿性環(huán)境，后處理不需要進(jìn)行過濾除去固體K2CO3，同時(shí)加入了相轉(zhuǎn)移催化劑。通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選最佳的溫度、時(shí)間以及原料配比，再采用正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化，產(chǎn)率提高了20%左右，并對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物采用質(zhì)譜和核磁結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確認(rèn)，隨后進(jìn)行了抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)報(bào)道如下。

1 試驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

儀器：核磁(NMR)-600 MHz測(cè)定(CDCl3，TMS為內(nèi)標(biāo)，瑞士Bruker公司)；ZF-I型三用紫外分析儀(藍(lán)尼詩爾商貿(mào)有限公司)；Finnigan-LCQDECA (ESI-MS)(美國(guó)熱電公司)；PSL-1810型磁力攪拌低溫槽(EYELA東京理化器械株式會(huì)社)。

試劑：無水三乙胺、K2CO3、N,N-二甲基酰胺、(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇(阿達(dá)瑪斯試劑公司)。

1.2 合成方法

以三溴化磷和(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇為原料，以四氫呋喃為溶劑，反應(yīng)得到2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪，再與化合物對(duì)氨基苯甲酸甲酯化合物經(jīng)過親核取代反應(yīng)得到4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸甲酯川芎嗪氨類衍生物，最后經(jīng)過水解得到4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸(3d)，川芎嗪氨類衍生物合成路線如圖1所示。

圖1 川芎嗪氨類衍生物合成路線

1.2.12-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪中間體的制備

在氬氣保護(hù)、無水條件下，將雙頸圓底燒瓶置于低溫反應(yīng)器中冷至-5 ℃，加入5.0 mmol PBr3冷卻并攪拌5 min，再加入無水三乙胺0.34 mL繼續(xù)攪拌2～3 min，再稱取15.2 mmol(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇溶于20 mL 四氫呋喃溶液中，用滴液漏斗緩慢滴加到雙頸圓底燒瓶中，待滴加結(jié)束后，將反應(yīng)裝置轉(zhuǎn)移至室溫反應(yīng)8 h，TLC板檢測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后真空旋除殘留溶劑，殘留物加冰水進(jìn)行淬滅，并用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，真空旋除溶劑，殘留物經(jīng)硅膠柱層析進(jìn)行分離純化，最后得到2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪。

1.2.24-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸的合成

在氬氣保護(hù)、無水條件下，將雙頸圓底燒瓶置于低溫反應(yīng)器中冷卻至-5 ℃，稱取200 mgNaH置于25 mL的雙頸圓底燒瓶中，再加入一定量對(duì)氨基苯酯類化合物，再稱取2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪531.6 mg，相轉(zhuǎn)移催化劑四丁基碘化銨0.05 g，最后量取15 mL N,N-二甲基酰胺溶劑加入雙頸圓底燒瓶中。反應(yīng)溫度85 ℃、8 h得到目標(biāo)產(chǎn)物，硅膠柱分離純化得到4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸(3d)川芎嗪衍生物。

1.2.3結(jié)構(gòu)確認(rèn)

m.p.131-133℃.1H NMR (MeOD,150 MHz)δ=6.73(s,1H,Ar-H),7.81(s,1H,Ar-H),6.75(s,1H,Ar-H),7.82(s,1H,Ar-H),2.56(s,3H,CH3),2.55(s,3H,CH3),2.52(s,3H,CH3),4.46(s,2H,CH3).13C NMR (MeOD,600 MHz)δ=152.53,151.81,151.81,149.63,148.66,148.27,147.40,131.31,131.21,118.14,112.20,45.47,19.82,19.66,18.69.川芎嗪衍生物3d結(jié)構(gòu)譜圖1H NMR(見圖2)和13C NMR(見圖3)。

圖2 化合物3 d的13C NMR

圖3 化合物3d的1H NMR

1.3 抗血小板聚集試驗(yàn)方法

將制備好的富血小板血漿放在搖床里37 ℃溫育20 min，用移液槍吸取180 μL溫育好的PRP加入96孔板中，加樣時(shí)避免產(chǎn)生氣泡，如果有氣泡用加熱的針頭扎破。再加入10 μL待測(cè)藥品，終濃度為100、50、25、12.5、6.25 μg/mL，37 ℃溫育振搖5 min，將酶標(biāo)儀設(shè)置為震動(dòng)1次時(shí)間為10 s，波長(zhǎng)為570 nm。將96孔板置于酶標(biāo)儀上快速震搖10 s測(cè)定吸光度，每30 s測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)3次，記各孔3次吸光度均值為A0。之后加入誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷(ADP)終濃度為5 μmol/L，繼續(xù)每30 s測(cè)定一次吸光度直至吸光度不再變化，記平行孔的吸光度均值為A，阿司匹林為陽性對(duì)照。

1.4 工藝優(yōu)化

本工藝主要對(duì)第2步2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪與對(duì)氨基苯甲酸甲酯化合物反應(yīng)合成的川芎嗪氨類衍生物進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，以考察反應(yīng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1反應(yīng)溶劑的考察

反應(yīng)溶劑對(duì)收率的影響考察結(jié)果見表1。

表1 反應(yīng)溶劑對(duì)收率的影響

由表1可知：乙腈、四氫呋喃沸點(diǎn)較低，不能滿足實(shí)驗(yàn)要求的溫度。使用甲苯產(chǎn)率也相對(duì)較低，為60%。選擇DMF作為溶劑，產(chǎn)率可高達(dá)91%。

2.1.2反應(yīng)時(shí)間的考察

以1 mmol 2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪為定量，選擇DMF為溶劑，改變反應(yīng)時(shí)間，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)收率的影響，結(jié)果見表2。

表2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)收率的影響

由表2可知：隨時(shí)間延長(zhǎng)，反應(yīng)產(chǎn)率不斷變大，8 h反應(yīng)進(jìn)入高峰期，11 h收率下降。

2.1.3原料配比考察

以1 mmol 2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪為定量，改變對(duì)氨基苯酯類化合物的量，考察了原料配比對(duì)收率的影響，結(jié)果見表3。

表3 反應(yīng)原料配比對(duì)收率的影響

由表3可知：反應(yīng)原料配比為1∶0.8時(shí)，收率可達(dá)72%；增加對(duì)氨基苯酯化合物的量，收率變大，當(dāng)配比為1∶1.2時(shí)收率最大，繼續(xù)增加對(duì)氨基苯酯化合物的量，收率變小。

2.1.4反應(yīng)環(huán)境考察

以1 mmol 2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪為定量，考察了反應(yīng)環(huán)境堿性的強(qiáng)弱對(duì)收率的影響，結(jié)果見表4。

表4 反應(yīng)環(huán)境對(duì)收率的影響

由表4可知：堿性強(qiáng)弱對(duì)反應(yīng)的收率有較高的影響。K2CO3的收率為52%。強(qiáng)堿NaH的收率高達(dá)89%。

2.1.5反應(yīng)溫度考察

由表5可知：溫度對(duì)反應(yīng)的收率有較高的影響。65 ℃時(shí)的收率為68%，85 ℃時(shí)的收率高達(dá)88%。

表5 反應(yīng)溫度對(duì)收率的影響

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素考察預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇反應(yīng)時(shí)間(A)、反應(yīng)配比(B)、反應(yīng)溫度(C)3個(gè)因素為考察因素，截取各因素3個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，因素及水平見表6，正交試驗(yàn)見表7，方差分析結(jié)果見表8。

表6 因素水平

水平A(反應(yīng)時(shí)間/h)B(反應(yīng)溫度/℃)C(反應(yīng)配比)14651∶128851∶1.23121001∶1.4

表7 正交實(shí)驗(yàn)L9(34)結(jié)果分析

表8 方差分析

從表7正交實(shí)驗(yàn)L9(34)結(jié)果分析得出：最優(yōu)的組合為A2B2C3，即反應(yīng)時(shí)間為8 h，反應(yīng)配比為1∶1.2，反應(yīng)溫度為85 ℃時(shí)產(chǎn)率最高。從表8方差分析可以看出：反應(yīng)時(shí)間(A)、反應(yīng)溫度(B)對(duì)產(chǎn)率有顯著的影響(P<0.05)，而反應(yīng)配比(C)對(duì)產(chǎn)率影響相對(duì)不大。

2.3 實(shí)驗(yàn)活性評(píng)價(jià)

通過正交試驗(yàn)篩選的最佳合成路線得到的4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸(3 d)，其抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)活性要好于陽性對(duì)照阿司匹林IC50=37.38<42.96，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見表9、10。

表9 阿司匹林對(duì)血小板聚集的影響

表10 阿司匹林對(duì)血小板聚集的影響

3 討論

根據(jù)單因素和正交試驗(yàn)獲得的合成目標(biāo)產(chǎn)物收率，確定了本工藝合成的最佳實(shí)驗(yàn)條件：反應(yīng)溶劑為DMF、反應(yīng)時(shí)間為8 h、反應(yīng)配比為1∶1.2、堿性環(huán)境為NaH、反應(yīng)溫度為85 ℃。

本工藝方法比傳統(tǒng)方法收率更高，反應(yīng)過程檢測(cè)及后處理變得簡(jiǎn)單，同時(shí)原料易獲得。得到的川芎嗪衍生物的收率高達(dá)88%，比文獻(xiàn)報(bào)道的合成方法得到的產(chǎn)物收率提高了20%，實(shí)驗(yàn)后處理不需要過濾分離，更節(jié)省時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)采用三溴化磷作為鹵化反應(yīng)的親和試劑，而氯化亞砜有刺激性臭味反應(yīng)劇烈，在使用氯化亞砜的過程中會(huì)生成大量HCl和SO2，對(duì)環(huán)境造成污染，同時(shí)氯化亞砜易發(fā)生水解反應(yīng)，造成產(chǎn)率下降。因此，本合成工藝對(duì)環(huán)境污染很小。

抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本研究合成的川芎嗪衍生物具有抗血小板聚集作用且效果好于陽性對(duì)照阿司匹林。本研究合成的川芎嗪衍生物羧基在15位碳原子上，16位和17位羧基取代活性還需進(jìn)一步研究；同時(shí)，血小板在制備的過程中，抗凝劑會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)分析產(chǎn)生誤差，防止血凝的方法還需要改進(jìn)。