張鶴山， 陳志宏2， 田 宏， 熊軍波， 劉 洋

(1.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430064； 2.全國畜牧總站， 北京 100125)

白三葉(TrifoliumrepensL.)為豆科車軸草屬多年生草本植物，起源于地中海地區(qū)[1]，廣泛分布于世界各地[2]。白三葉作為優(yōu)質(zhì)蛋白飼料喂養(yǎng)家畜已有幾個(gè)世紀(jì)[3]。其生態(tài)防護(hù)、土壤固氮等方面的作用亦為人們所認(rèn)識(shí)，在農(nóng)牧漁業(yè)生產(chǎn)中具有十分重要的地位。隨著我國南方草地畜牧業(yè)的發(fā)展，白三葉栽培種植區(qū)域不斷擴(kuò)大，已在云、貴、川、鄂、湘、蘇、皖等省人工草地建設(shè)中得到廣泛應(yīng)用。資料表明，在云南20萬hm2人工草地上有近一半草地混播了白三葉[4]，湖北省也有近4萬hm2人工草地種植了白三葉[5]，成為當(dāng)?shù)禺?dāng)家草種之一。

我國白三葉育種進(jìn)程相對(duì)落后，到目前為止通過全國草品種審定委員會(huì)登記的白三葉品種僅6個(gè)。因此，引進(jìn)國外品種進(jìn)行栽培成為提升我國草牧業(yè)發(fā)展水平的重要措施，但由于育種目標(biāo)和地域的異同，栽培材料在國內(nèi)表現(xiàn)出顯著的差異性，這些差異不僅表現(xiàn)在表型特征，也有內(nèi)在的遺傳背景差異。研究這些差異特性是進(jìn)一步利用這些資源的基礎(chǔ)，也為白三葉新品種的培育提供技術(shù)支撐。

分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)用于基因鑒定、性狀遺傳、基因定位、種譜分析以及輔助育種等方面[6]。在可獲得的DNA標(biāo)記輔助系統(tǒng)中，簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeats，SSR)標(biāo)記(又名微衛(wèi)星DNA)被認(rèn)為是植物染色體組分析的理想技術(shù)[7]，它是基于PCR的共顯性標(biāo)記[8]，通常與非重復(fù)的DNA區(qū)域結(jié)合[9]，并且在同一物種的不同群體間高度表達(dá)[10-13]。在白三葉中，基于SSR標(biāo)記的白三葉遺傳多樣性研究已經(jīng)開展。Jones et al.用78個(gè)SSR引物對(duì)和57個(gè)AFPL(擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)引物對(duì)標(biāo)記了135個(gè)位點(diǎn)[14]。Barrett 等[15]利用365個(gè)SSR引物標(biāo)記了493個(gè)位點(diǎn)。在國內(nèi)，李莉等[16-17]基于SSR標(biāo)記研究了貴州野生白三葉的遺傳多樣性，Zhang 等[18]利用343個(gè)SSR引物對(duì)標(biāo)記了415個(gè)位點(diǎn)。因此，SSR分子標(biāo)記技術(shù)可以用于白三葉種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究，并從本質(zhì)上反映研究材料的差別，為白三葉標(biāo)記輔助育種提供技術(shù)支持。

本研究擬利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，從DNA水平分析國內(nèi)外49份白三葉種質(zhì)資源的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，旨在為白三葉資源評(píng)價(jià)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料共49份，均為來自國內(nèi)外的白三葉栽培或野生材料(表1)。每份材料種植4 m2(2 m×2 m)，于分枝期取樣。

DNA提取、引物合成由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取與檢測(cè)

取白三葉健康嫩葉，采用改良CTAB法提取基因組DNA，并用核酸檢測(cè)儀NanoDrop ONE檢測(cè)DNA濃度與純度，將合格DNA樣品置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2SSR引物設(shè)計(jì)

基于白三葉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，利用軟件MicroSatellite(MISA)進(jìn)行EST-SSR位點(diǎn)掃描，然后通過Primer 5.0軟件對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，參數(shù)設(shè)定為：引物長度18～25 nt，最適長度為21 nt；引物退火溫度為55～65 ℃，最優(yōu)退火溫度為60 ℃；PCR產(chǎn)物長度范圍為80～500 bp；GC含量在40%～60%之間，最優(yōu)GC含量為50%。按堿基重復(fù)發(fā)明初步使用109對(duì)EST-SSR引物，利用8個(gè)不同地區(qū)的樣本研究引物的擴(kuò)增效率及多態(tài)性，篩選明顯多態(tài)性條帶的引物48對(duì)。

為更清晰的讀取譜帶數(shù)據(jù)，將每個(gè)引物的正向引物(F引物)加上通用M 13接頭序列“TGTAAAACGACGGCCAGT”，得到M 13接頭引物，另外再合成加HEX熒光基團(tuán)的M 13熒光接頭引物。

1.2.3SSR-PCR擴(kuò)增體系與電泳檢測(cè)

以待測(cè)樣品DNA為模板，以反向引物、M 13接頭引物和熒光基團(tuán)的M 13熒光接頭引物使用三引物PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)優(yōu)化體系總體積為10μL，其中包括1μL模板DNA，5μL的2×Taq PCR Master Mix，0.1μL濃度為10 pmol·μL-1的正向引物，0.4μL濃度為10 pmol·μL-1的反向引物，0.4μL濃度為10 pmol·μL-1的帶熒光M 13引物，滅菌水補(bǔ)足10μL。

SSR-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；然后95 ℃變性30 s，57.5～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；接著95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共8個(gè)循環(huán)；最后72 ℃末端延伸10 min，于4 ℃保存。

將獲得的熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管熒光電泳檢測(cè)，讀取毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)條帶檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

將步驟D得到的條帶檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行人工比對(duì)、校正，根據(jù)條帶的有無，賦以“1”或“0”，缺失數(shù)據(jù)記為“-9”，建立“0,1”分子數(shù)據(jù)矩陣；根據(jù)分子數(shù)據(jù)矩陣，統(tǒng)計(jì)EST-SSR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)；利用POPGEN v 1.32軟件計(jì)算各引物對(duì)的Shannon信息多樣性指數(shù)(I)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(He)；利用NTSYS-PC 2.10軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)并基于UPGMA方法對(duì)白三葉樣品個(gè)體進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建得到UPGMA聚類樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選及擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析

利用8個(gè)白三葉材料篩選出48對(duì)具有多態(tài)性引物，并以這48對(duì)引物對(duì)49份白三葉材料進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，引物擴(kuò)增結(jié)果見表2。48對(duì)引物共擴(kuò)增出441譜帶，其中多態(tài)性譜帶439條，各引物多態(tài)性條帶比率范圍為75%～100%，平均多態(tài)性條帶比率為99.5%，僅2個(gè)引物多態(tài)性比率低于100%，其中引物TR 03多態(tài)性比率為75%，引物TR 22多態(tài)性比率為90%；從擴(kuò)增譜帶數(shù)量看，引物擴(kuò)增多態(tài)性譜帶數(shù)最低為3條(引物TR 03、TR 05、TR 14和TR 48)，最高為20條(引物TR 26)，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出9.15條多態(tài)性譜帶；Nei’s基因多樣性指數(shù)范圍在0.105～0.429之間，平均值為0.254；Shannon信息指數(shù)范圍在0.206～0.618之間，平均值為0.399，表明白三葉材料遺傳多樣性十分豐富，SSR-PCR分子標(biāo)記能夠很好地檢測(cè)白三葉遺傳位點(diǎn)，可以用于白三葉遺傳多樣性分析及種質(zhì)系譜分析。

表1 白三葉材料基本信息

序號(hào)材料編號(hào)材料名稱材料來源材料類型D01CF0000562450中國貴州野生材料D02CF000805L116MLC美國栽培材料D03CF000806克爾利卡(Cllilka)丹麥栽培材料D05CF000808塔瑪(Tamar)新西蘭栽培材料D06CF000810里維德爾(RIVENDEL)英國栽培材料D08CF000868米爾克(Milka)丹麥栽培材料D09CF002737克羅蒂克(Klondick)美國栽培材料D10CF005812克塞(Kersey)英國栽培材料D11CF005829303美國栽培材料D13CF005832阿里斯(Alice)新西蘭栽培材料D16CF005836狄曼德(Demand)新西蘭栽培材料D17CF005837利瑞帕(Lirepa)新西蘭栽培材料D18CF005838利邦(Libon)新西蘭栽培材料D19CF005839魯斯特(Luster)新西蘭栽培材料D20CF005840麥維(Merur)新西蘭栽培材料D21CF005841奧克恩(Okain)新西蘭栽培材料D22CF005842奧文(Oluen)新西蘭栽培材料D23CF005843普羅普(Prop)新西蘭栽培材料D24CF005844羅蒙納(Romona)新西蘭栽培材料D25CF005845塔荷拉美國栽培材料D26CF005846PG85K新西蘭栽培材料D27CF005848雷萬達(dá)(RivenDel)新西蘭栽培材料D28CF005850JL0812中國吉林野生材料D29CF005851威力(Wili)新西蘭栽培材料D30CF005852米利(Meli)美國栽培材料D31CF022343鋪地(Pitau)美國栽培材料D32CF022344那努克荷蘭栽培材料D33CF022345戰(zhàn)斗丹麥栽培材料D34CF022347米羅荷蘭栽培材料D35CF022348克朗(Crown)丹麥栽培材料D36CF022349巴比安(Barbian)荷蘭栽培材料D37CF022350CHQ03-104中國四川野生材料D38CF022352CHQ03-114中國四川野生材料D40CF022354YN03-293中國云南野生材料D42CF022360YN03-312中國云南野生材料D43CF022362科龍迪(KLWA13)丹麥栽培材料D44CF022364百霸荷蘭栽培材料D45CF022398流浪者(NomaD)新西蘭栽培材料D47CF0223991044美國栽培材料D48CF022414肯尼亞(Kenya)法國栽培材料D49CF022415哈芒安(RVP.Itacon)英國栽培材料D50CF022445錫拉(Siral)澳大利亞栽培材料D51CF0224471442新西蘭栽培材料D52CF022450Ez lucero inTA阿根廷栽培材料D54CF022449FRWKL2德國栽培材料D55CF022349FRWKL1德國栽培材料

表2 SSR引物擴(kuò)增信息

引物名稱堿基重復(fù)退火溫度/℃等位基因數(shù)NTA多態(tài)性基因數(shù)NPA多態(tài)性基因比率/%Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(He)Shannon信息多樣性指數(shù)(I)TR01CAGCA(6×4)60.0011.00111000.22690.3596TR02TTC(3×7)57.509.0091000.23560.3663TR03TTCTCC(6×4)60.004.003750.25110.3797TR04GAA(3×7)60.008.0081000.28880.4329TR05ATG(3×7)59.003.0031000.18600.3006TR06ACCGCC(6×4)60.007.0071000.30440.4723TR07AAAAAC(6×4)60.007.0071000.42860.6184TR08GTA(3×8)60.009.0091000.21770.3618TR09CAT(3×9)58.0016.00161000.10510.2059TR10CAC(3×7)60.006.0061000.24100.3665TR11TTCTAA(6×6)60.006.0061000.21670.3650TR12ATG(3×15)60.0012.00121000.28800.4464TR13ACAAC(5×5)60.008.0081000.29530.4601TR14TGA(3×6)59.003.0031000.42430.6153TR15TGT(3×6)60.0015.00151000.20900.3540TR16ACAAC(5×5)60.005.0051000.37600.5520TR17GAA(3×6)60.007.0071000.28320.4306TR18TCA(3×9)59.0011.00111000.26750.4248TR19TATGA(5×4)60.007.0071000.24280.3817TR20ATAA(4×5)60.009.0091000.39980.5817TR21TTTGT(5×4)60.0012.00121000.22550.3643TR22CAC(3×8)60.0010.009900.16980.2827TR23AAT(3×8)58.0011.00111000.19860.3312TR24TGA(3×7)60.009.0091000.29980.4500TR25CTT(3×11)59.009.0091000.27400.4243TR26ATT(3×13)59.0020.00201000.13720.2455TR27GAT(3×13)59.0013.00131000.19970.3241TR28GAA(3×12)60.0013.00131000.24530.3929TR29ATG(3×14)60.0016.00161000.12840.2336TR30CATAGC(6×6)59.005.0051000.28370.4540TR31ATC(3×25)60.0017.00171000.22020.3636TR32CATA(4×7)60.006.0061000.23380.3762TR33TCC(3×12)60.0012.00121000.20830.3405TR34ATG(3×7)60.007.0071000.28150.4357TR35ATC(3×5)60.0012.00121000.12490.2297TR36CTC(3×5)60.006.0061000.29380.4404TR37GAA(3×8)60.006.0061000.28050.4438TR38GA(2×7)60.0015.00151000.20460.3345TR39ATG(3×7)60.0012.00121000.20580.3332TR40AGA(3×10)59.007.0071000.21230.3512TR41TAG(3×7)59.006.0061000.29570.4533TR42CTC(3×11)60.0010.00101000.22590.3617TR43TAT(3×7)59.007.0071000.30460.4541TR44TCA(3×7)60.009.0091000.26490.4149TR45TCC(3×7)59.0014.00141000.23500.3792TR46AAC(3×6)60.007.0071000.26870.4179

圖1 49份白三葉材料的UPGMA聚類圖

2.2 多態(tài)性聚類分析

以441個(gè)位點(diǎn)的譜帶數(shù)據(jù)建立“0,1”矩陣，利用NTSYS-PC 2.10軟件基于UPGMA法對(duì)49個(gè)白三葉材料進(jìn)行聚類分析，得到UPGMA聚類圖(見圖1)。結(jié)果表明，材料間的遺傳相似系數(shù)最大的為0.842(D 24和D 60)，最小的為0.693(D 03和D 59)。基于遺傳相似系數(shù)的聚類分析表明，在遺傳相似系數(shù)為0.748處可將所有白三葉材料分為四大類。第Ⅰ大類包括45份材料，涵蓋了所有來源國的材料；第Ⅱ大類包括2份，來自新西蘭(D 24)和中國(D 60)；第Ⅲ大類包括1份材料，來自丹麥(D 03)；第Ⅳ大也包括1份材料，來自中國(D 59)。在遺傳相似系數(shù)為0.76處，第Ⅰ大類可分為6個(gè)小組，第1小組包括3份材料，來自中國、美國和新西蘭；第2小組包括28份材料，來自美國、新西蘭、澳大利亞、丹麥等國；第3小組包括3份材料，來自美國、英國和荷蘭；第4小組包括3份材料，來自新西蘭、德國和荷蘭；第5小組也包括3份材料，來自中國、美國和新西蘭；第6小組包括1份材料，來自新西蘭。

3 討論與結(jié)論

3.1 白三葉不同種質(zhì)間存在豐富的多樣性

群體的遺傳多樣性與SSR標(biāo)記位點(diǎn)變異程度有關(guān)，群體多樣性越豐富，其位點(diǎn)變異程度越大，Shannon信息多樣性指數(shù)越高。本研究中，49份白三葉品種SSR位點(diǎn)Shanon信息多樣性指數(shù)平均值為0.399，略低于李莉?qū)F州野生白三葉SSR標(biāo)記位點(diǎn)的平均值0.475，高于張婧源對(duì)70份白三葉材料的SSR標(biāo)記位點(diǎn)的平均值0.334[21]，說明不同白三葉種質(zhì)間差異較大，其遺傳多樣性較為豐富。從遺傳相似系數(shù)看，49份白三葉材料的遺傳相似系數(shù)分布在0.693～0.842之間，平均值為0.760，反映了種質(zhì)材料多樣的遺傳關(guān)系。本研究中，白三葉材料多為栽培品種，盡管其來自世界各地，并且具有不同的經(jīng)濟(jì)性狀或內(nèi)在差異特性，但經(jīng)過多年栽培馴化其種群內(nèi)的多樣性豐富程度較野生型有所差異。

3.2 栽培馴化過程可影響白三葉種質(zhì)的遺傳信息

種質(zhì)材料來源地或地理位置是影響種質(zhì)材料遺傳關(guān)系的重要因素，通常來說來自同一地區(qū)或地理生態(tài)區(qū)的種質(zhì)材料具有相近的遺傳信息，在聚類分析中就具有更近的遺傳相似系數(shù)，這已經(jīng)被前人所證實(shí)[21-23]。但本研究中來自同一國家(地區(qū))的材料并沒有聚類在一類，可能是由于本研究中白三葉材料多為育成品種，其育種材料的原始來源地所屬國不一定是培育國，不同國家育成的不同品種可能其原始親本采集地相近。比如序號(hào)D 50材料Siral，其培育國是澳大利亞，但其原始植株采集地來自非洲的阿爾及利亞[4]。實(shí)際上，中國大部分白三葉品種都由國外引進(jìn)，比如云南地區(qū)僅在20世紀(jì)80年代就引進(jìn)三葉草品種近200個(gè)，在長期馴化過程中出現(xiàn)了豐富的性狀變異。但是，對(duì)于一些野生材料，基本來源地相同的材料能夠聚為同一類，比如來自中國云南的野生材料D 37和D 38被聚為一類，其遺傳相似系數(shù)為0.794。

3.3 基于轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)白三葉多態(tài)性引物是可行的

SSR分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性、分子標(biāo)記輔助育種以及生物進(jìn)化的研究[24-25]，其引物篩選是開展分子標(biāo)記的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基于測(cè)序數(shù)據(jù)開發(fā)SSR標(biāo)記成為一種可能。本研究利用白三葉轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)出的48對(duì)SSR引物標(biāo)記對(duì)白三葉進(jìn)行遺傳多樣性分析，其擴(kuò)增譜帶多態(tài)性比率達(dá)99.5%，高于白三葉同類指標(biāo)結(jié)果[16,19,20]，表明基于轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)白三葉多態(tài)性引物是可行的、有效的。