鄧素芳 程春振 林玉玲 賴鐘雄

摘 ?要??本文以閩侯野生蕉（阿寬蕉，Musa itinerans）果皮為研究對象，對不同顏色（綠色和紫色）果皮進行轉錄組測序，旨在探討miRNA在野生蕉不同顏色果皮轉錄后水平中發(fā)揮的作用及其可能參與的調控通路，為芭蕉屬植物果皮顏色分子調控機制的研究奠定基礎。取野生蕉同一果梳上不同顏色（紫色和綠色）的果皮為材料，利用高通量測序和生物信息學分析，獲得野生蕉不同顏色果皮組織的miRNA表達譜，篩選不同顏色果皮差異表達的miRNA并預測相關靶基因，通過靶基因分析，獲得與調控野生蕉果皮顏色可能相關的信號通路。結果從不同顏色野生蕉果皮中共獲得34.11兆條原始讀長，經過濾后得到28.73兆條clean reads，從中鑒定出132個已知的miRNA序列和122個新的miRNA;篩選出36個差異表達miRNA，其中10個在紫色果皮中上調表達，26個在綠色果皮中上調表達。表達量最高的miRNA為mit-miR167，而差異倍數(shù)最大的為mit-miR172a-3p-2。差異表達miRNA共預測出1164個靶基因可能參與野生蕉果皮顏色調控，并主要在DNA結合、離子跨膜運輸活動等功能和植物病原互作等途徑富集。其中，有7個基因直接與苯丙烷生物合成途徑相關，主要受到miR156和miR482家族的調控。同時，選取6個差異表達miRNA進行定量驗證，結果表明，3個miRNA在綠色果皮中上調表達，3個miRNA在紫色果皮中上調表達，定量結果與高通量測序的結果一致。本文通過高通量測序獲得了野生蕉果皮miRNA表達譜，并通過生物信息學分析得到可能和調控野生蕉果皮顏色性狀相關的miRNA和代謝通路。綜上所述，野生蕉果皮顏色可能受到多種miRNA的調控，并涉及多個代謝通路，這有助于進一步了解果皮花青素轉錄后水平的調控過程，并對進一步的功能驗證奠定基礎。

關鍵詞 ?野生蕉;果皮;花青素;miRNA;差異表達中圖分類號??S686; S668.1??????文獻標識碼??A

miRNA Expression Profile and Target Gene Analysis of Different Color Peels in Wild Banana （Musa itinerans）

DENG Sufang^1，2， CHENG Chunzhen¹， LIN Yuling¹， LAI Zhongxiong^1*

1. Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 2. Agricultural Ecology Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350013， China

Abstract ?In this paper， the transcriptome sequencing of different color peels （green and purple） of Minhou wild banana （Musa itinerans） was carried out to investigate the role and the possible regulatory pathways of miRNA involved in the post-transcriptional level regulation of peel color， which would lay the foundation for the study of the peel color molecular regulation mechanism of the genusMusa. In the experiment， different color （purple and green） peel tissues on the same fruit comb of wild banana were used for miRNA analysis. Through miRNA sequencing and bioinformatics analysis， the miRNA expression profiles of different color peel tissues in wild banana were obtained. The differentially expressed miRNAs were screened and the related target genes were predicted. Through the target gene analysis， the signal pathways which is related to peel color traits were proposed. As a result， a total of 34.11 million original reads and 28.73 million clean reads were obtained from the green and purple peel tissues. Among them， 132 known miRNAs and 122 new miRNAs were identified; 36 differentially expressed miRNAs were screened out， of which 10 were up-regulated in purple peel and 26 were up-regulated in green peel. The miRNA with the highest expression was mit-miR167， and the one with the largest difference was mit-miR172a-3p-2. A total of 1164 target genes of differentially expressed miRNAs were predicted， which may be involved in the regulation of wild banana peel color， and were mainly enriched in functions such as DNA binding， anion transmembrane transporter activity， and plant pathogen interaction pathways. Among them， there were 7 genes directly related to the phenylpropanoid biosynthesis pathway， and were mainly regulated by the miR156 and miR482 families. At the same time， six differentially expressed miRNAs were selected for quantitative verification. The results showed that three miRNAs were up-regulated in green peel and three miRNAs were up-regulated in purple peel. The quantitative results were consistent with the results of high-throughput sequencing. In this study， the miRNA expression profiles of wild banana peels were obtained， and the miRNAs and metabolic pathways which may be related to the regulation of color traits of wild banana peel were obtained by bioinformatics analysis. These results indicated that the color trait of wild banana peel may be regulated by a variety of miRNAs and involves multiple metabolic pathways， which would help to further understand the post-transcriptional level regulation of anthocyanins in the peel and lay the foundation for further functional verification.

Keywords ?Musa itinerans; peel; anthocyanin; miRNA; differential expression

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.010

分布于我國華南地區(qū)的野生蕉——阿寬蕉（Musa itinerans）是一類觀葉、觀果的芭蕉屬植物，廣泛應用于園林綠化中。福建野生蕉資源非常豐富，許多野生蕉因富含花青素^[1]而具有紫紅色的果實，觀賞性很強，為芭蕉屬植物觀賞性狀改良提供了優(yōu)異的基因資源?；ㄇ嗨刈鳛橐环N水溶性天然可食用色素，不僅在植物顯色及生長發(fā)育中起作用，還具有醫(yī)療保健功效，是植物觀賞性狀和品質改良的一個重要研究內容。隨著分子生物學的快速發(fā)展，植物花青素的生物合成途徑已經比較明確，但花青素生物合成調控的分子機制非常復雜，除了受結構基因和轉錄因子的共同調控外，近年來的許多研究也表明miRNAs可以通過靶向調控花青素合成的MYB、bHLH和WD40等多種轉錄因子，實現(xiàn)對花青素的轉錄后水平調控。如在擬南芥中，miR156的靶基因SPL9通過降低MBW復合物的穩(wěn)定性來抑制花青素的合成和積累^[2];miR827通過調控靶基因NLA參與花青素的生物合成^[3];miR858通過靶基因MYB12調控黃酮類物質的生成途徑來影響花青素的生物合成^[4-5];miR828通過對TAS4剪切產生許多siRNA，共同靶向花青素合成相關的PAP1/MYB75、PAP2/MYB90、MYB113，從而影響花青素的合成^[6-7]。此后，有越來越多的研究表明miRNA參與植物花青素的轉錄后調控^[8-9]。

隨著高通量測序技術的快速發(fā)展，應用測序技術在鑒定花青素合成相關miRNA方面的研究也越來越多，也篩選出了一些和花青素相關的miRNA^[9-10]，但在芭蕉屬植物果皮顏色方面的篩選工作鮮有報道。而通過高通量測序技術獲得野生蕉不同顏色果皮miRNA表達譜，并篩選和果皮花青素合成相關miRNA，對系統(tǒng)研究野生蕉轉錄后調控花青素具有重要的意義。因此，本研究通過對野生蕉不同顏色果皮進行miRNA-Seq高通量測序，挖掘可能調控野生果皮顏色的miRNA，為后續(xù)研究野生蕉果皮顏色調控的分子機制奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1材料

系列試驗所用材料均為種植于福建農林大學園藝植物生物工程研究所試驗地的閩侯野生蕉^[11]。該野生蕉為通信作者于2011年在閩侯三疊井采集后移栽至試驗基地。經過幾年的觀察，果皮紫色性狀穩(wěn)定。試驗取同一果樹上不同顏色（綠色和紫色）的果皮組織，用編號GP表示綠色果皮，PP表示紫色果皮，見圖1。

1.2方法

1.2.1??樣品采集、RNA的提取、文庫構建與測序??取樹上剛采下的野生蕉果梳，用削皮刀剝下表面帶顏色的果皮，在液氮下迅速研磨成粉末，用北京天恩澤公司生產的柱式植物RNAOUT 2.0試劑盒（Column Plant RNAOUT 2.0 Kit）提取總RNA后，交由北京百邁客生物科技有限公司進行文庫構建，并在Illumina Hiseq 2500平臺進行測序。

1.2.2??數(shù)據(jù)處理??（1）將測序得到的原始序列去除接頭序列和短于18?nt或長于30 nt的序列等低質量序列，獲得高質量序列（即clean reads）用于后續(xù)分析。（2）Bowtie（http：//bowtie-bio.?Source forge.net/），用于序列比對，獲得包含miRNA的Unannotated reads。（3）將Unannotated reads與植物miRNA數(shù)據(jù)庫（miRbase 20.0，http：//www.?MiRb ase.org/）中的已知miRNA進行比對，獲得保守miRNA的數(shù)目及家族分布。同時使用Musa_Itinerans_v1作為參考基因組（http：//?banana-?genome-hub.southgreen.fr/organi sm/?Mu sa/Itinerans）進行新的miRNA預測、序列比對和后續(xù)分析。（4）用TPM算法歸一化處理miRNA的表達量，對2個樣本中miRNA表達量進行統(tǒng)計。差異表達miRNA的篩選以校正后的p-value即錯誤發(fā)現(xiàn)率FDR（false discovery rate）≤0.05，2個樣本間表達量差異倍數(shù)FC在2倍以上即|log₂（FC）|≥1作為條件。（5）對得到的miRNA（已知的miRNA和新預測的miRNA）用Target Finder軟件進行靶基因預測。（6）用DAVID 軟件（http：//david.abcc.?Ncifc rf.?gov/）進行KEGG通路分析和GO分析，用富集因子（enrichment factor）分析差異表達miRNA靶基因的KEGG通路富集程度。

1.2.3??cDNA及引物的合成??對提取的總RNA用北京全式金生物技術有限公司生產的miRNA反轉錄試劑盒（TransScript miRNA RT Enzyme Mix）進行cDNA的合成。用ABI公司的Primer Express Software v2.0設計候選基因用于熒光定量PCR的引物，委托深圳華大基因公司合成引物，引物序列信息見表1。

1.2.4 ?Real-time qPCR分析??用Real-time qPCR檢測野生蕉不同顏色果皮中差異表達miRNA的

相對表達量。反應體系包括5?mL Nuclease-Free?Water、8 μL 2×SYBGEEN PCR mix（QIAGEN）、1 μL上游引物、1 μL下游引物、1 μL樣品cDNA，構成總體積為20 μL反應體系。反應條件為95?℃變性2 min，94?℃?10 s，60?℃?10 s，72?℃?40 s，50個PCR循環(huán)，采用默認設置自動生成Ct值。RT-qPCR相對定量的內參選擇U6。每個樣品設置3個重復。以綠色果皮的基因表達量為對照，用相對定量2^-ΔΔCt法計算分析基因的表達水平。

2??結果與分析

2.1測序數(shù)據(jù)質量評估

通過高通量測序，從GP和PP 2個小RNA文庫中分別獲得了14 505 778和19 523 133條原始reads，原始數(shù)據(jù)已上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫，登錄號分別為SRR9945688和SRR9945687。去除低質量讀數(shù)、未知堿基N含量≥10%讀數(shù)、接頭序列、poly（A）讀數(shù)以及短于18 nt或長于30 nt的讀段后，分別獲得11?311?826和17?420 104條clean reads，占原始reads的77%以上（表2）。

利用Bowtie軟件將clean reads與Silva、GtRNAdb、Rfam和Repbase數(shù)據(jù)庫進行比對，去除了rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和重復序列后，獲得了包括miRNA在內的未經注釋reads，這部分數(shù)據(jù)分別占2個文庫總小RNA原始reads的67.05%和71.52%（圖2）。此外，2個數(shù)據(jù)集中rRNA的比例小于31%，表明2個sRNA文庫的質量很高。未注釋reads中，2個文庫（GP和PP）與Musa itinerans基因組相匹配的reads分別占54.54%和55.52%。

許多研究表明，不同長度的小RNA具有不同的功能。例如，21?nt的小RNA通常調控轉錄后的基因沉默，而24?nt的小RNA通過RNA依賴的DNA甲基化和異染色質維持介導基因的沉默^[12-13]。因此，我們調查了2個文庫小RNA序列的長度分布，結果表明，2個文庫小RNA序列的長度分布相似，主要在18 nt到30 nt長度之間變化（圖3）。長度在21～24 nt的小RNA序列，占全部數(shù)據(jù)的60%以上。2個文庫中24 nt小RNA均占優(yōu)勢，分別占總數(shù)據(jù)的28.08%（GP）和28.93%（PP）。典型的21 nt長度的miRNA，在2個小RNA文庫中的數(shù)量位居第二，分別占14.51%（GP）和18.99%（PP）。這些結果與在擬南芥^[14]、水稻^[15]、普通小麥^[16]、大豆^[17]、蘋果^[18]、茄科茄

屬^[19]和蘿卜^[20]等成熟植物觀察到的小RNA長度分布一致。另外，在紫色果皮中，長度小于或等于24?nt的小RNA比綠色果皮中的多，特別是21?nt小RNA的豐度差異尤為顯著;長度大于24?nt的小RNA相對豐度則相反，在綠色果皮中要比在紫色果皮中的多。

2.2野生蕉果皮miRNA的鑒定

使用Ssearch36軟件將與基因組匹配的讀本與miRBase（V21.0）數(shù)據(jù)庫中已知的植物成熟miRNA進行比對，獲得閩侯野生蕉保守的miRNA序列，結果共鑒定出132個已知的miRNA序列和122個新的miRNA。對獲得的254個miRNA序列進行miRNA家族分析，研究這些miRNA在進化中的保守性。結果表明，這些基因來自58個miRNA家族（圖4）。這些保守的miRNA家族成員數(shù)目顯著不同。例如，miR156家族成員數(shù)量最多，有21名成員，其次是miR396和miR171-1家族，分別有20名和18名成員。

從各miRNA家族表達量統(tǒng)計結果來看，miR159、miR319家族的miRNA表達總量顯著高于其他家族（圖5）。統(tǒng)計結果表明家族成員多的基因家族總表達量不一定多，如miR319家族只有6個成員，但它的表達量卻位于所有miRNA家族的第2位。表達量前10位的miRNA見表3。

由于miRNA長度影響其調控作用，我們統(tǒng)計了254個miRNA的長度分布范圍。結果表明，所鑒定的miRNA長度在18～25 nt范圍內分布，其中長度為21 nt的miRNA所占比例最高，為48.03%，另有19.29%的miRNA長度在24 nt，而18 nt的miRNA所占的比例最低，為0.39%;已知的132個miRNA長度分布相對較集中，范圍在19～22?nt之間，其中20?nt和21?nt的miRNA占了85.61%;122個新的miRNA長度分布范圍同總的miRNA分布范圍一致，18～25 nt的miRNA都有，其中，24 nt長度的miRNA數(shù)量最多，占40.16%，其次是20 nt的miRNA，占33.61%（圖6）。

2.3不同顏色果皮差異表達的miRNA分析

為了了解果皮2種顏色差異表達的miRNA，用綠色果皮為對照，計算Log₂FC，以校正后的P-value（FDR）≤0.05，|log₂（FC）|≥1為標準，篩選出

2種顏色果皮差異表達的miRNA，結果從新鑒定的254個野生蕉果皮miRNA中，篩選出36個差異表達的miRNA，它們來源于16個已知的miRNA家族，結果如圖7所示。這36個差異表達的miRNA中，有10個在紫色果皮中上調表達，26個在綠色果皮中上調表達。

為了更直觀地了解野生蕉果皮差異表達miRNA的表達情況，對篩選出的差異表達miRNA做層次聚類分析，將具有相同或相似表達行為的miRNA進行聚類，結果見圖8。從圖8可以看出，這36個miRNA在不同顏色的果皮中具有差異表達模式，根據(jù)表達量及差異顯著性可以劃分為4類：（1）平均表達量TPM<20的miRNA有9個，包括mit-miR157d-3p、mit-miR172a-3p-2、mit-?miR160-5p、mit-miR482-2、mit-miR156f-5p、mit-?miR156b-5p、mit-miR156、mit-miR399和mit-?miRn4;（2）平均表達量201100的miRNA有6個，包括mit-?miR167b-5p、mit-miR167、mit-miR396b-3p、mit-?miR528-5p、mit-miR535和mit-miRn2。

2.4差異表達miRNA靶基因的預測與注釋

為了更好地了解不同顏色野生蕉果皮差異表達miRNA的功能，用Target Finder軟件對在不同

顏色果皮中差異表達的36個miRNA進行了靶基因預測，考察了它們的功能注釋和富集情況。結果表明，36個差異表達的miRNA共預測到1164個靶基因，其中有1085個靶基因獲得公共數(shù)據(jù)庫的注釋。其中，經過與GO數(shù)據(jù)庫比對，共有482個差異表達miRNA的靶基因獲得注釋。這些靶基因分布在40個GO功能二級分類中，結果見圖9。差異表達miRNA的靶基因功能主要涉及生物學過程分類中的代謝過程、細胞過程和單一有機體過程，細胞組分分類中的細胞部分、細胞和生物體，分子功能分類中的結合和催化活性等GO功能條目。

通過差異miRNA靶基因的KEGG注釋結果統(tǒng)計，共有371個靶基因注釋到KEGG的酶，其中有198個靶基因關聯(lián)到59個KEGG代謝通路上，如圖10所示。其中，涉及植物-病原互作、植物激素信號傳導、核糖體和氨基酸生物合成等4個具體途徑的靶基因數(shù)較多。而注釋到次生代謝物合成的靶基因，主要集中在苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）途徑中，包含預測出的7個靶基因。

在苯丙烷生物合成通路中（圖11），多數(shù)目標基因集中在苯丙烷生物合成的下游，其中4個基因在紫色果皮中下調表達，3個基因上調表達，且這些差異表達miRNA的靶基因主要受到miR156和miR482家族的調控?？梢钥吹?，一個

靶基因受到多個miRNA的共同調控，而同一個家族的miRNA可以調控多個靶基因。

2.5差異表達miRNA靶基因GO功能和KEGG通路富集分析

為了更好地描述不同顏色果皮中檢測到的差異表達miRNA靶基因，將預測出的靶基因進行了GO功能和KEGG途徑富集分析。結果表明，差異表達miRNA靶基因主要在DNA結合（DNA binding）、離子跨膜運輸活動（anion transmembrane

transporter activity）、高滲的響應（hypero smotic response）、DNA代謝過程（DNA metabolic process）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、有機離子轉運（organic anion transport）、細胞分化（cell differentiation）和蛋白磷酸化（protein phosphorylation）等8個生物學過程顯著富集（表4）。

KEGG通路富集分析表明，差異表達miRNA靶基因主要在植物-病原互作通路富集，富集因子達1.93（圖12）。

2.6差異表達miRNA靶向的轉錄因子分析

鑒于植物miRNA具有傾向于靶定轉錄因子

的特點，本文考察了差異表達miRNA的靶基因中轉錄因子的情況，結果找到了160個靶基因與轉錄因子有關，其中有65個注釋為MYB/MYB-?related基因，19個注釋為bHLH，3個注釋為WD40，12個注釋為WRKY，17個注釋為AP2基因，35個注釋為SPL（圖13）。將野生蕉果皮中靶定轉錄因子的miRNA進行統(tǒng)計，結果表明，注釋為MYB轉錄因子的靶基因主要是由

miR159、miR858和miR482等家族調控，注釋為轉錄因子AP2的靶基因主要是由miR172和miR482家族調控，注釋為SPL轉錄因子的靶基因主要是由miR156和miR535家族調控，注釋為bZIP的靶基因主要是由miR396和miR482家族調控（表5）。

2.7差異表達miRNA定量PCR驗證

為了驗證RNA-seq獲得的miRNA表達模式，選取了6個在野生蕉不同顏色果皮中差異表達的miRNA（mit-miR156k、mit-miR319c、mit-miR167 b-5p、mit-miR166a、mit-miR528-5p、mit-miR 858b）進行RT-qPCR，將2種分析結果（RNA-seq和RT-qPCR）進行比較，進行定量驗證（圖14）。結果表明，供試的6個基因中，mit-miR156k、

mit-miR166a、mit-miR528-5p在綠色果皮中上調表達，而mit-miR319c、mit-miR 167b- 5p、mit-miR 858b?3個miRNA在紫色果皮中上調表達，與高通量測序的結果一致。

3??討論

3.1野生蕉果皮miRNA具有品種特異性

Ghag等^[21]在2個栽培香蕉品種Grand Naine（AAA subgroup Cavendish）和Rasthali（AAB subgroup Silk）的研究中，發(fā)現(xiàn)了miRNA具有明顯的品種特異性，2個品種分別具有44%～53%的特異性miRNA。宋順等^[22]在3個植物保守miRNAs響應香蕉不同品種（巴西蕉、大蕉、皇帝蕉）的抗枯萎病特性表達分析中也發(fā)現(xiàn)miRNA具有明顯的品種特異性。本研究利用RNA-seq測序技術，共從野生蕉果皮中鑒定了254個miRNA，其中132個miRNA具有保守miRNA序列，比對上已知的其他物種miRNA，而有122個miRNA為野生蕉果皮特異的，占總數(shù)的48.03%。此外，本研究獲得的miRNA中，保守的已知miRNA以21?nt長度為主，野生蕉特異的新的miRNA以24?nt為主，21?nt次之，這與2個栽培香蕉品種Grand Naine （AAA subgroup Cavendish）和Rasthali （AAB subgroup Silk）的miRNA長度也有所不同，它們24nt miRNA數(shù)量遠大于其他長度的miRNA數(shù)量^[21]，但卻與香蕉Musa acuminataColla（AAA Group）cv. Berangan 根中的miRNA長度分布一致^[23]。這些都證實了芭蕉屬植物miRNA具有明顯的品種特異性。

3.2 可能參與野生蕉果皮花青素合成的miRNAs

通過對差異表達miRNA的靶基因GO功能和KEGG途徑富集分析顯示，靶基因主要在DNA結合和離子跨膜運輸活動等功能和植物病原互作等途徑富集，也有一些靶基因富集在苯丙烷代謝途徑中，有些靶基因可能是參與花青素合成的MYB、bHLH、WD40、WRKY、SPL、AP2等轉錄因子，暗示野生蕉果皮顏色調控的分子機制復雜而多樣。

在不同顏色果皮中我們共獲得36個差異表達的miRNA，它們多數(shù)（26個miRNA）在紫色果皮中呈下調表達，而上調表達的基因主要來自miR160、miR167-1、miR171-1、miR399、miR482和miR5272家族的10個成員。已有研究報道Sly-miR167在番茄果實破色期的豐度增強^[24]，在我們的研究中預測到的miR167-1（mit-miR 167b-5p、mit-miR167）在紫色果皮中表達量TPM大于3000，這2個miRNA可能與Sly-miR167一樣，在果皮花青素的合成中起調控作用，但這些都還需進一步通過試驗驗證。

另外，通過差異表達miRNA靶基因的預測也發(fā)現(xiàn)，野生蕉果皮中表達的miRNA159/miRNA 319和miRNA858b靶定的基因，同陸地棉等植物一樣^[25]，也多數(shù)是編碼MYB轉錄因子的基因，可能參與植物花青素的調控。許多證據(jù)證明，miRNA858調控與花青素相關的MYB基因的表達，如番茄中miR858能在轉錄后水平通過對靶基因Sly-MYB12和Sly-myb-like的作用負調控花青素的生物合成。通過與轉錄組數(shù)據(jù)^[26]的關聯(lián)分析也發(fā)現(xiàn)野生蕉果皮靶向MYB的miRNA也有miRNA858b，而且它在紫色果皮中上調表達，但差異未能達到顯著（log₂FC=0.96），它是否在野生蕉果皮顏色調控中起作用還需更進一步的研究。此外，研究中還發(fā)現(xiàn)2個屬于miR482家族的miRNA（mit-miR482-1、mit-miR482-2）靶向調控MYB基因，但目前研究表明，miR482家族主要靶向NBS-LRR病害抗性基因，而對MYB基因的調控尚未見報道?？偠灾?，以上這些預測均需進一步的研究才能證實。

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