葉山亮，周偉杰，郭科航，卓澤偉，盧銓，張宸，駱昱均,陳浩，沙衛(wèi)紅

急性輻射小腸損傷(radiation-induced intestinal injury，RIII)是放射性治療常見的并發(fā)癥，尤其是盆腔、腹腔惡性腫瘤病人接受放射治療后，發(fā)生率高達75%[1]。常見臨床表表現為腹痛、腹瀉、便血等，嚴重損傷患者出現血樣腹瀉、消化不良、脂肪瀉、貧血、全身感染等，嚴重影響著患者的生活質量[2-3]。然而，目前的臨床治療療效有限。因此，臨床上需要更好的治療方法。

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)是一類能夠自我更新并且有多向分化能力的干細胞。當前多項研究顯示BM-MSCs移植對修復腸道黏膜損傷有良好的治療作用[4]，如炎癥性腸病[5]、壞死性小腸結腸炎[6]和腸缺血再灌注損傷[7]均有明顯的修復療效。除此之外，間充質干細胞還具有抑制炎癥和直接促進再生的作用[8]。然而，在BM-MSCs移植中，存在醫(yī)源性腫瘤形成的可能、細胞排斥反應和輸注毒性的風險，而且BM-MSCs靜脈注射后，大部分細胞以微小的栓子形式滯留在肺臟、肝臟內，減少了它們在病灶中的含量以及作用[9-10]。以上的不足嚴重限制了BM-MSC移植的臨床應用。

骨髓間充質干細胞條件培養(yǎng)基(conditioned medium derived from bone marrow-mesenchymal stem cells， MSC-CM)含有間充質干細胞的旁分泌因子以及營養(yǎng)因子，可以下調炎癥，起到保護腸黏膜的作用，還可避免BM-MSCs移植的不足，被認為是BM-MSCs的理想替代。課題組前期發(fā)現TNF-α、IL-1β預刺激BM-MSCs后，可以增加其旁分泌的作用，但目前關于TNF-α、IL1β誘導的骨髓MSC-CM修復RIII的研究尚少。本研究旨在探討炎癥因子TNF-α、IL-1β預刺激骨髓MSC-CM與正常狀態(tài)下MSC-CM修復受損腸黏膜的差異以及作用機制，為BM-MSCs來源的條件培養(yǎng)基治療RIII提供實驗依據以及理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)雌Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，平均體重約153.47 g，4～5周齡，用于構建RIII模型。雌性SD大鼠10只，3～4周齡，體重在60～100 g，用于獲取BM-MSCs。SD大鼠均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，飼養(yǎng)于華南理工大學SPF級別動物中心。所有動物經檢疫符合實驗動物標準，實驗方法符合醫(yī)學倫理學要求。

骨髓間充質干細胞培養(yǎng)基(Cyagen公司)，胎牛血清(美國Hycolne公司)，抗大鼠CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC單克隆抗體(美國Biolegend公司)，成骨分化培養(yǎng)基(Cyagen公司)、成脂分化培養(yǎng)基(Cyagen公司)。TNF-α細胞因子(Cyagen公司)、IL1β細胞因子(Cyagen公司)DMEM-F12培養(yǎng)基(美國Hycolne公司)、TrypLEExpress胰酶替代物(美國Invitrogen 公司)。ELISA試劑盒(美國R&D公司)

1.2 方法

1.2.1 骨髓間充質干細胞分離、培養(yǎng)與鑒定 SD大鼠頸椎脫臼法處死后，摘除雙側股骨和脛骨，DMEM-F12培養(yǎng)基沖出骨髓，于離心機1 000 r/min，離心5 min，分離紅細胞及細胞碎片，再用體積分數為10%胎牛血清的BM-MSCs專用培養(yǎng)基重懸浮細胞，細胞懸液培養(yǎng)于T25瓶，置于37 ℃、體積分數為5% CO2、濕度90%的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每隔3 d換液。通過換液、傳代純化細胞，細胞培養(yǎng)至P3-P5，用作后續(xù)實驗。流式細胞儀對MSC細胞表型CD29、CD34、CD44、CD45進行鑒定。行成骨、成脂分化進行分化鑒定。

1.2.2 骨髓間充質干細胞條件培養(yǎng)基配置 條件培養(yǎng)基參照課題組方法配置。BM-MSCs融合度達到70%～80%時，放置低氧條件下培養(yǎng)，氧體積分數為0.5%，6h后加入外源TNF-α(6 ng/mL, Cyagen公司)與IL-1β(3 ng/mL，Cyagen公司)聯(lián)合培養(yǎng)，模擬炎癥刺激環(huán)境， 24 h后棄去原有培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，更換新鮮無血清DMEM-F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集該細胞培養(yǎng)液，此為TNF-α、IL-1β炎癥預激骨髓充質干細胞條件培養(yǎng)基(MSC-CMTNF-α+IL1β)。采用相似的方法，無血清DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)BM-MSCs 48 h后收集培養(yǎng)液體，此為正常狀態(tài)的無間充質干細胞條件培養(yǎng)基(MSC-CMNOR)，儲存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 RIII大鼠模型構建及實驗分組 SD大鼠進行吸入性麻醉，麻醉成功后，用鉛磚遮蔽除腹部以外的身體部位，利用PRIMUS? H直線加速器(X射線)以300 cGy/min的速率一次性照射，總劑量14.0 Gy進行腹部局部照射。造模成功后，SD大鼠出現腹脹、便血等表現，把SD大鼠按照以下分組：①無干預,正常對照組(n=20只);②RIII+200 μL DMEM-F12(n=20只);③RIII+200 μL MSC-CMNOR(n=20只);④RIII+200 μL MSC-CMTNF-α+IL-1β(n=20只)。每組SD大鼠在接下來的4 h內，尾靜脈分別一次性注射200 μL的DMEM-F12培養(yǎng)基、MSC-CMNOR和MSC-CMTNF-α+IL-1β。連續(xù)注射3 d，2 mL濃縮條件培養(yǎng)基裝于膠囊內，植入腹腔后以10 μL/h的速率勻速釋放。

1.2.4 腸道標本H&E染色 在放射損傷后第1、3、5、7天，每組在各個時間點隨機取5只大鼠，行頸椎脫臼法處死，距回盲部10～15 cm取出回腸約2 cm，縱行切開腸組織，冰磷酸鹽緩沖液(PBS)反復洗滌，10%中性福爾馬林中固定，石蠟包埋，切片厚度為 4 μm，蘇木素-伊紅(HE)染色，進行組織病理分析。取腸道黏膜50 mg，用于后續(xù)ELISA炎癥因子檢測。

1.2.5 小腸組織中促炎因子和抗炎因子水平檢測 取上述腸組織，用冰PBS漂洗腸組織，取10 mg腸組織加入1 mL PBS研磨，制備成組織勻漿，4 ℃ 12 000 rpm/min 離心30 min，取上清液，參照說明書，利用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-6、IL-10細胞因子水平。

1.2.6 血清中促炎因子和抗炎因子水平檢測 每個節(jié)點處死大鼠后，心臟采血1.5 mL，3 000 rpm/min離心10 min，上清為血清血漿，利用ELISA試劑盒檢測血清血漿TNF-α、IL-6、IL-33、IL-10細胞因子水平。

1.3 統(tǒng)計學計算

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況

對照組SD大鼠呼吸、活動度良好，進食可；RIII組在放射后第4、5、7天分別出現3、3、4只大鼠死亡；MSC-CMNOR處理組在第4、5、6天分別出2、3、3只大鼠死亡；MSC-CMTNF-α+IL1β處理組未見死亡。RIII組和RIII+MSC-CMNOR組大鼠出現明顯的活動度減少、腹脹、血便等，癥狀逐漸加重；而與上述兩組比較，MSC-CMTNF-α+IL1β組大鼠則未見明顯的的活動度減少、腹脹，偶有血便。四組大鼠輻射前體重分布滿足正態(tài)分布，各組之間無統(tǒng)計學差異(表1)。輻射后第3天，MSC-CMTNF-α+IL1β組大鼠的體重，比單純RIII及RIII+MSC-CMNOR組大鼠體重明顯更重,見表2。

表1各組大鼠的初始體重比較

注：RIII:放射性腸損傷；MSC-CMNOR:正常狀態(tài)下的骨髓間充質干細胞條件培養(yǎng)基；MSC-CMTNF-α+IL1β:TNF-α、IL1β預激活骨髓間充質干細胞條件培養(yǎng)基

表2各組大鼠在放射后第3天體重

注：RIII:放射性腸損傷；MSC-CMNOR:正常狀態(tài)下的骨髓間充質干細胞條件培養(yǎng)基；MSC-CMTNF-α+IL1β:TNF-α、IL1β預激活骨髓間充質干細胞條件培養(yǎng)基。*與MSC-CMTNF-α+IL1β干預組比較，P<0.05

2.2 各組大鼠小腸病理改變

放射損傷后第3天，各組病理改變明顯。RIII組及RIII+MSC-CMNOR組大鼠腸上皮細胞出現不同程度變性、壞死，絨毛縮短、脫落明顯，腺管排列紊亂，隱窩變淺或消失，炎癥細胞浸潤至黏膜下層。而MSC-CMTNF-α+IL1β治療組大鼠未見顯著的小腸上皮細胞壞死及絨毛縮短，隱窩結構未見明顯的病理改變(圖1)。

2.3 各組大鼠小腸炎癥因子水平

放射后第3天，損傷組及治療組的炎癥因子平衡改變，出現明顯的差異。MSC-CMTNF-α+IL1β干預組與RIII組、MSC-CMNOR干預組比較，在小腸黏膜處促炎因子TNF-α、IL-6顯著降低(P<0.05),抗炎因子IL-10顯著升高(P<0.05)；MSC-CMNOR干預組與RIII組比較，TNF-α的升高有統(tǒng)計學差異，而IL-6及IL-10的改變無明顯統(tǒng)計學差異,見表3。

2.4 各組大鼠血清中炎癥因子水平

在放射后第3天，炎癥因子出現顯著差異。與RIII組、MSC-CMNOR干預組比較，MSC-CMTNF-α+IL1β干預組幼鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-33明顯降低(P<0.05)，抗炎因子IL-10顯著升高(P<0.05)；MSC-CMNOR干預組與RIII組比較，促炎因子及抗炎因子未見明顯改變，見表4。

圖1圖為放射后第3天小腸組織學改變(蘇木素-伊紅染色，10×10)

表3各組大鼠腸組織中促炎因子和抗炎因子的水平

注：a與正常組比較，P<0.05；b與RIII組比較，P<0.05；c與MSC-CMNOR處理組比較，P<0.05

表4各組大鼠血清中促炎因子和抗炎因子的水平

注：a與正常組比較，P<0.05；b與RIII組比較，P<0.05；c與MSC-CMNOR處理組比較，P<0.05

3 討論

RIII是放射性療法常見的并發(fā)癥，特別是接受了放射性治療的腹腔、盆腔惡性腫瘤患者，臨床表現多樣，輕者表現為腹痛、腹脹、腹瀉、血便，病情嚴重者會出現劇烈的腹痛、血樣腹瀉、貧血、全身感染等。雖然目前臨床治療有較多的方法，但療效欠佳，嚴重地影響著患者的生活質量甚至有生命威脅[11]。隨著放射療法在腫瘤治療上的應用增多，患病人數也隨之增加[12-13]，急需更為有效的治療方法。

RIII的發(fā)病機制尚未完全明確，但主要認為是分裂活躍的腸上皮，尤其是腸隱窩干細胞暴露在放射性細胞毒性下的結果[14]。在動物模型與患者的流行病學研究發(fā)現，疾病與放射線的劑量、放射性區(qū)域內小腸的體積、患者的營養(yǎng)狀況有關等因素有關[15-16]。本實驗通過對SD大鼠進行準確的射線損傷干預后，成功構建了RIII大鼠模型。大鼠腹脹、便血、活動量減少、體重不增等臨床表現明顯；病理學檢測示小腸絨毛縮短脫落、隱窩消失或變淺、炎癥細胞大量浸潤等，符合RIII的病理改變。該模型的構建模擬了RIII主要的致病因素，臨床表現及病理表現符合RIII，使后續(xù)的治療更有信服力。

隨著對疾病的了解，炎癥反應被認為在RIII發(fā)病機制中起著主要的作用[17-18]。我們利用TNF-α、IL-1β促炎因子，模擬腸道炎癥環(huán)境，刺激MSCs旁分泌。與RIII損傷組、MSC-CMNOR干預組比較，MSC-CMTNF-α+IL1β干預組能明顯地減輕腸道黏膜受損程度，腸組織中觀察到促炎因子TNF-α、IL 6顯著降低、抗炎因子IL 10明顯升高；同時，在血清中也觀察到TNF-α、IL 6、IL 10有著相同的改變。MSC-CMTNF-α+IL1β干預組大鼠腹脹、便血等表現均有改善； 而MSC-CMNOR干預后，RIII模型的臨床表現及炎癥因子無明顯改變。本研究表明炎癥預刺激MSCs條件培養(yǎng)基能夠抑制炎癥，修復腸上皮細胞。根據目前國內外的研究，我們推測MSC-CMTNF-α+IL1β抑制炎癥反應主要是通過培養(yǎng)基內的外泌體。外泌體是細胞分泌的囊泡樣結構，直徑在30～100 nm之間，其攜帶著各種蛋白質及RNA，參與細胞的增殖、分化、炎癥調節(jié)等多種生命活動[19]。研究表明，在多種疾病模型中，外泌體均表現出抑制炎癥的作用。在腸缺血再灌注引起的肺損傷疾病模型中，MSCs來源外泌體可以調節(jié)TLR4/NF-κB信號通路，改變促炎因子與抗炎因子的平衡，減輕炎癥損傷[20]；在結腸炎中，MSCs來源的外泌體通過免疫抑制來減輕炎癥，緩解腸黏膜損傷[21]；在多發(fā)性硬化中，MSCs來源的外泌體通過調節(jié)小膠質細胞的極化，緩解中樞神經系統(tǒng)的炎癥與脫髓鞘程度[22]。對于RIII，目前研究發(fā)現TLR4通路在疾病的修復當中有著重要的作用，TLR4通路的激活可以上調多種細胞因子，如前列腺素E2、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，修復腸上皮細胞[23-24]，從而調節(jié)細胞活動，修復損傷。所以，MSCs來源的外泌體可能是調節(jié)TLR4信號通路，減少細胞凋亡，促進細胞增殖，平衡促炎因子與抗炎因子水平，減輕炎癥程度，從而修復腸黏膜上皮細胞。但目前尚未有證據證明這一假設，需要進一步探討證實。另外，腸道微菌群的平衡在RIII發(fā)病中也起著一定的作用，研究發(fā)現，放射性腸損傷的腸道菌群失衡，腸內菌群免疫環(huán)境遭破壞，致使腸上皮細胞凋亡[25]。因此，MSCs來源的外泌體也可能通過調節(jié)腸道微生物種群的比例及腸道免疫，修復腸道受損黏膜。

總的來說，炎癥因子TNF-α、IL1β模擬炎癥環(huán)境，預激活骨髓間充質干細胞后，可以促進骨髓間充質干細胞的旁分泌，產生更多細胞因子及營養(yǎng)因子。炎癥預刺激骨髓間充質干細胞條件培養(yǎng)基通過調節(jié)促炎因子與抗炎因子的平衡，抑制炎癥，修復輻射性腸損傷受損腸道。這項研究顯示炎癥預刺激骨髓間充質干細胞條件培養(yǎng)基作為新的治療方式展示了美好的前景，為日后臨床應用打下了實驗及理論基礎。