王 藝，張 弛，丁貴杰，黎之騫

（1.貴州民族大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

馬尾松Pinus massoniana是我國南方地區(qū)針葉樹種中面積最大、分布最廣、綜合利用程度最高的鄉(xiāng)土樹種[1]，是典型的先鋒樹種和外生菌根樹種[2]。外生菌根是土壤中的外生菌根真菌與植物根系形成的一種互惠共生結(jié)構(gòu)，它可以通過外延菌絲擴(kuò)大植物根系的吸收面積，改善土壤中礦質(zhì)元素的形態(tài)，增強(qiáng)植物對(duì)營養(yǎng)和水分的攝取能力，提升植物的抗旱能力[3]。近年來，一些研究者相繼報(bào)道了菌根對(duì)植物生長形態(tài)[4-5]、養(yǎng)分吸收[6]、水分狀況[7-8]及光合特性[9-10]影響的研究，但多集中于內(nèi)生菌根[11-12]，對(duì)于外生菌根的研究較少[13-14]，特別是對(duì)于干旱脅迫下外生菌根對(duì)苗木水分生理和光合特性的影響報(bào)道更少[15-16]。

干旱是限制林木生長發(fā)育的重要逆境因子，它影響種子萌發(fā)，降低幼苗存活率[17-18]。貴州省雖屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，降雨量充沛，但許多地區(qū)土層淺薄，山體滲漏性強(qiáng)，容易發(fā)生階段性干旱。因此，利用菌根植物抗旱特性，以先鋒樹種馬尾松作為外生菌根模式植物，研究外生菌根對(duì)植物抗旱性的影響，對(duì)解決地表侵蝕嚴(yán)重地區(qū)的生態(tài)恢復(fù)和促進(jìn)林木生長具有重要現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

在前期研究基礎(chǔ)上，選取5 株對(duì)馬尾松促生效果較好的外生菌根真菌為供試菌株，分別是褐環(huán)乳牛肝菌Suillus luteusSL7&SL1，簡稱S7 和S1，采集于重慶金佛山；雞油菌Cantharellus cibarius，簡稱G，和彩色豆馬勃Pisolithus tinctoriusStrain Pt 715，簡稱C，均采自四川西昌桉樹林下；土生空?qǐng)F(tuán)菌Cenococcum geophilumStrain Cg SIV，簡稱T，從西班牙歐洲火炬松林下土壤分離。菌種由西南大學(xué)黃建國教授所提供，對(duì)照（CK）為不接菌。馬尾松種子于2010 年2 月采自貴州省都勻市馬鞍山林場(chǎng)優(yōu)良母樹林，儲(chǔ)藏后備用，所用苗木在大棚內(nèi)自育。采用Pachlewski 固、液培養(yǎng)基[19]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子及土壤處理 2010 年3 月選擇籽粒飽滿的馬尾松種子，75%乙醇消毒1 min，無菌水沖洗5 次，在初始溫度40℃溫水中浸泡24 h，取出用濕紗布包裹，置于25℃恒溫箱催芽，種子裂嘴露白時(shí)可播種。試驗(yàn)基質(zhì)采用黃壤與河砂混合，體積比9：2，高壓滅菌鍋（壓力0.14 Mpa,124～ 126℃）2 h 連續(xù)滅菌。塑料花盆規(guī)格250 mm×280 mm，95%的酒精消毒。供試土壤基本性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤基本化學(xué)性質(zhì)Table 1 Basic chemical properties of soil used in the experimental

1.2.2 播種和接種 在苗床上均勻噴灑液體菌劑800 mL·m-2，然后將催芽的種子條播于苗床上（1.6 g·m-2），最后再將100 mL 菌劑噴灑于種子周圍，覆土。CK 以同樣方式加等量無菌培養(yǎng)液。試驗(yàn)在苗圃大棚內(nèi)進(jìn)行，夏季平均相對(duì)濕度78%，平均溫度27℃。各菌種處理間用隔板間隔約30 cm 避免交叉污染。當(dāng)苗木達(dá)1 年生時(shí)，選擇生長一致的苗木移栽至盆內(nèi)，正常生長后（一個(gè)星期），進(jìn)行干旱脅迫試驗(yàn)。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用雙因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，因素A 為接種處理（播種時(shí)進(jìn)行）：分別接種S7，G，S1，C，T 和CK；因素B 為4 個(gè)水分梯度處理，通過稱質(zhì)量補(bǔ)水法控制土壤相對(duì)含水量為：正常水分（65±5）%、輕度脅迫（50±5）%、中度脅迫（35±5）%和重度脅迫（25±5）%（以下簡稱正常、輕度、中度和重度）。每處理10 盆，每盆3 株，重復(fù)3 次，干旱脅迫2 個(gè)月后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

待苗木半年生時(shí)，各接種處理隨機(jī)抽40 株苗進(jìn)行侵染率檢測(cè)[20]，發(fā)現(xiàn)菌根化苗木侵染率均達(dá)100%，而未接種苗木侵染率為0。脅迫試驗(yàn)結(jié)束后，取苗測(cè)定葉片相對(duì)含水量RWC、水分飽和虧缺WSD、葉片水勢(shì)LWP、自由水含量、束縛水含量和葉綠素等生理指標(biāo)[21-22]。用Li-6400 便攜式光合作用儀（Li-Cor，Lincoln，Nebraska，USA）在晴朗天氣的8：00-18：00 之間測(cè)定各光合參數(shù)指標(biāo)。每處理取樣3 株，自上而下選擇第3 至第4 葉序處的功能葉一片，重復(fù)3 次。根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算光合耗水量、氣孔限制值Ls[23]、水分利用效率WUE[24]、光能利用效率LUE[25]和CO2利用效率CUE[26]。

光合耗水量為蒸騰速率Tr與凈光合速率Pn的比值。

式中，Ls為氣孔限制值，Ca和Ci分別為空氣和胞間CO2濃度。

式中，E為蒸騰速率。

式中，PAR為光合有效輻。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SAS（Release6.03）統(tǒng)計(jì)軟件[27]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、Duncan 多重比較及主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)菌根化馬尾松苗水分生理的影響

2.1.1 外生菌根真菌對(duì)苗木葉片相對(duì)含水量RWC和水分飽和虧WSD的影響 由圖1 可知，外生菌根真菌提高了苗木的RWC，降低了WSD，與CK 間差異顯著（P＜0.05）。隨著干旱脅迫的增加，CK 苗木的RWC逐漸降低，WSD逐漸增加。而菌根化苗木則變化不一，其中接種S1 和C 的苗木RWC隨干旱脅迫的加劇逐漸增加，分別比各自在正常水分條件下RWC含量增加9.2%和3.5%；而接種S1 和T 的苗木W(wǎng)SD隨干旱脅迫的加劇逐漸減低，分別比各自在正常水分條件下WSD含量降低9.3%和4.9%。相同水分下，菌根化苗木RWC均顯著高于CK（P＜0.05），而WSD則顯著低于CK。輕度、中度和重度脅迫時(shí)，接種S1 的苗木RWC含量最高，分別比CK增加了76.8%，154%和185%，而WSD含量最低，分別比CK 下降了40.0%，41.0%和45.6%。

圖1 干旱脅迫對(duì)苗木葉片相對(duì)含水量和水分飽和虧缺的影響Figure 1 Effect of water stress on relative water content and water saturation deficit in leaf of seedlings

2.1.2 外生菌根真菌對(duì)馬尾松苗木水勢(shì)LWP的影響 由圖2 可見，隨干旱脅迫的增加，菌根化苗木LWP先增后降，均在中度脅迫時(shí)達(dá)最大，與各自在正常水分條件下相比，LWP增幅大小依次是：C（194%）＞G（175%）＞S7（134%）＞T（128%）＞S1（126%）；而CK 的隨水分降低逐漸增加。相同水分下，菌根化苗木LWP均低于CK，其中以接種S1 的苗木LWP最低，4 種干旱脅迫梯度相應(yīng)地比CK 降低了：38%（正常），33%（輕度），39%（中度）和46%（重度），說明接種外生菌根真菌能降低苗木LWP，而干旱脅迫對(duì)苗木LWP有一定影響，中度脅迫后，菌根化苗木LWP開始逐漸降低，與外界形成水勢(shì)梯度，利于根系吸收水分，這是苗木對(duì)干旱的適應(yīng)性反應(yīng)。

圖2 水分脅迫對(duì)苗木葉片水勢(shì)的影響Figure 2 Effect of water stress on leaf water potential in seedlings

2.1.3 外生菌根真菌對(duì)苗木自由水和束縛水的影響 由圖3 可知，隨干旱脅迫的加劇，接種S7，S1 和T 的苗木自由水含量先降后增，在中度脅迫時(shí)最低，與各自在正常水分條件下相比，自由水降幅為：S7（38%）＞S1（27%）＞T（26%）；接種G，C 和CK 苗木則逐漸降低，重度脅迫時(shí)最低。對(duì)于苗木束縛水含量，接種S7，S1，T 和CK 苗木先增后降，在中度脅迫時(shí)達(dá)最大，與各自在正常水分條件下相比，束縛水增幅為：T（173%）＞S1（116%）＞S7（96%）＞CK（43%）。而接種G 和C的苗木逐漸增加，與各自在正常水分條件下相比，束縛水增幅為：50%和76%。

輕度脅迫時(shí)，接種S7 的苗木自由水含量最高，比CK 增加248%；中度和重度脅迫時(shí)，接種S1 的苗木自由水含量最高，分別比CK 提高151%和252%，差異顯著（P＜0.05）。苗木束縛水含量，在輕度、中度和重度脅迫時(shí)，以接種S1 的含量最高，分別比CK 提高63%，157%和98%，差異顯著（P＜0.05）。

可見，干旱脅迫下苗木主要通過降低體內(nèi)自由水含量，增加束縛水含量，增強(qiáng)保水力，提高自身抗旱能力。而外生菌根能顯著改善苗木水分狀況，即使在干旱脅迫下菌根化苗木仍能表現(xiàn)出明顯效果。

圖3 干旱脅迫對(duì)苗木自由水和束縛水含量的影響Figure 3 Effect of water stress on free water and bound water content in leaf of seedlings

2.2 干旱脅迫對(duì)菌根化馬尾松幼苗光合指標(biāo)的影響

2.2.1 外生菌根真菌對(duì)苗木葉綠素的影響 不管是在正常水分條件下，還是在相同的干旱脅迫條件下（表2），各菌根化苗木葉綠素含量均高于CK，說明外生菌根提高了苗木葉綠素含量。隨著干旱脅迫加劇，苗木葉綠素含量逐漸下降，其中CK 降幅最大，高達(dá)28.6%，可見CK 比菌根化苗木受到干旱傷害更大，從另一方面也說明外生菌根真菌能減少干旱脅迫對(duì)馬尾松幼苗的傷害。

2.2.2 外生菌根真菌對(duì)馬尾松苗木光合特性的影響 多重比較結(jié)果表明（表3），隨著干旱脅迫加劇，苗木Pn，Gs的變化趨勢(shì)相同，均呈先增后減，中度脅迫時(shí)最大，其中接種S1 的苗木效果最好，Pn和Gs比在正常水分條件下分別增加48.6%和34.4%；而Ls和光合耗水量均在輕度脅迫時(shí)最低，菌種S1 的作用最明顯。干旱脅迫初期，菌根化苗木以降低Tr，減少水分消耗的方式適應(yīng)干旱環(huán)境。Ci的變化則與苗木Tr的變化趨勢(shì)相反。

表2 干旱脅迫對(duì)馬尾松幼苗葉綠素含量的影響Table 2 Effect of water stress on chlorophyll content in leaf of seedlings

表3 干旱脅迫對(duì)外生菌根真菌對(duì)馬尾松幼苗光合特性的影響Table 3 Effect of water stress on photosynthetic properties in different treated seedlings

相同水分下，菌根化苗木間Pn，Ci，Ls和光合耗水量等指標(biāo)差異顯著（P＜0.05）。外生菌根真菌能顯著提高苗木Pn，各水分條件下，均以接種S1 的苗木Pn最大；菌根化苗木Tr低于CK（重度脅迫時(shí)除S7 和T）。菌根化苗木Gs均高于CK，輕度和中度脅迫下，以接種S1 的苗木Gs最大，分別比CK 增加了54.9%和63.6%，但差異不顯著（P＞0.05）。外生菌根真菌能顯著提高苗木Ci，菌種S1 作用最明顯。菌根化苗木Ls均小于CK，兩者差異顯著（P＜0.05）。從菌根真菌對(duì)試驗(yàn)苗木光合耗水量影響看，接種能有效減少馬尾松苗木的光合耗水量，接種與非接種苗之間差異顯著（P＜0.05），其中菌株S1 作用最明顯。

2.2.3 外生菌根真菌對(duì)馬尾松苗木光合資源利用效率的影響 隨干旱脅迫加劇，CO2，水分和光能3 種資源利用效率均呈先增后降趨勢(shì)，WUE輕度脅迫時(shí)最大，而LUE和CUE在中度脅迫時(shí)最大，說明干旱脅迫對(duì)資源利用效率影響不同。外生菌根真菌能有效提高苗木光合資源利用效率，與CK 間差異顯著（P＜0.05，表4）。輕度脅迫時(shí)，接種S1 的苗木W(wǎng)UE最高，較CK 增加212%；中度脅迫時(shí)，S1 的LUE 最高，T 的CUE最高，分別比CK 增加了62%和45%。

由資源利用效率的計(jì)算公式可知，3 種資源利用效率均與光合速率成正比，外生菌根真菌能顯著提高苗木Pn，降低苗木Tr，Ls和光合耗水量，因此，外生真菌能顯著提高資源利用效率，對(duì)苗木生長起著積極的促進(jìn)作用。

表4 干旱脅迫下外生菌根真菌對(duì)馬尾松苗木資源利用效率的影響Table 4 Effect of water stress on efficiency of resource utilization in different treated seedlings

2.3 干旱脅迫下菌根化馬尾松苗木抗旱指標(biāo)的主成分分析

選取Pn，Tr，Gs，Ci，Ls，光合耗氧量，葉綠素，WUE，LUE，CUE，RWC，WSD，自由水含量（編號(hào)X1～ X13）13 項(xiàng)指標(biāo)，對(duì)菌根化苗木的抗旱性進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。計(jì)算結(jié)果表明（表5），前3 個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)86.167%。第一主成分貢獻(xiàn)率為49.35%，載荷較高且符號(hào)為正的有Pn，LUE，Gs，CUE等，故稱光合利用效率因子；第二主成分貢獻(xiàn)率為27.56%，載荷較高的有Ls，Tr，光合耗水量，故稱氣孔限制因子；第三主成分貢獻(xiàn)率為9.26%，載荷較高的有自由水，RWC，WUE等，故稱水分因子。

根據(jù)因子得分系數(shù)，計(jì)算出6 種菌根接種處理苗木單因子的得分值F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3 和綜合得分值F（表6），抗旱性由強(qiáng)到弱順序?yàn)椋篠1＞T＞S7＞G＞C＞CK，說明接種S1 的苗木抗旱能力最強(qiáng)。

表6 菌根化幼苗單因子綜合得分及排序Table 6 The top six factors of treated seedlings

3 結(jié)論與討論

3.1 干旱脅迫下外生菌根真菌改變了馬尾松苗木水分代謝，提高了水分利用效率

以往認(rèn)為菌根主要是通過擴(kuò)大菌絲網(wǎng)，來擴(kuò)大根系吸收面積，降低土壤與植物之間的液流阻力（Rs-p）[28]，增強(qiáng)根系對(duì)水分吸收能力；同時(shí)菌套還能防止根系水分喪失，改善植物水分狀況，尤其在土壤干旱條件下更為明顯[29]。前期研究除證明上述觀點(diǎn)外，還從生理角度，進(jìn)一步揭示外生菌根能增加植物抗旱生理，使菌根化苗木各項(xiàng)生理指標(biāo)產(chǎn)生明顯變化[30-31]，而本研究發(fā)現(xiàn)，這種變化直接改變了馬尾松菌根苗水分生理，使苗木含水量增加，水勢(shì)和水分飽和虧缺降低，從而增強(qiáng)保水力，使苗木只輕微感受到干旱脅迫，且能繼續(xù)正常生長發(fā)育，可見干旱對(duì)菌根苗的影響不大，其中菌種S1 表現(xiàn)最好。

3.2 干旱脅迫下外生菌根真菌增強(qiáng)了馬尾松苗木光合特性，提高了資源利用效率

干旱脅迫對(duì)光合特性的影響過程是極其復(fù)雜的。Caravaca 等[32]報(bào)道干旱脅迫下接種G.intraradices提高了木犀欖Olea europaea植株的光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度。高悅等[15]報(bào)道外生菌根真菌能明顯提高馬尾松、濕地松Pinus elliottii和黑松P.thunbergii菌根苗針葉中的葉綠素含量。宋微等[16]報(bào)道菌根真菌接種對(duì)楊屬Populus樹種葉綠素、凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度均起積極促進(jìn)作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，無論在正常還是干旱脅迫下，外生菌根真菌均能顯著提高馬尾松苗木的葉綠素，Pn，Gs和資源利用效率。較高的Pn使菌根化苗木Gs增強(qiáng)，資源利用效率提高，氣孔對(duì)水分的阻力減小，Ls降低，從而提高菌根化苗木對(duì)水分的吸收。此結(jié)果進(jìn)一步印證了李志輝等[33]提出的光合速率對(duì)氣孔導(dǎo)度具有反饋調(diào)節(jié)作用，即在有利于葉肉細(xì)胞光合時(shí)，氣孔導(dǎo)度增大，而不利于光合時(shí)，氣孔導(dǎo)度減小。光合速率的下降分為氣孔限制和非氣孔限制兩類，如果氣孔限制是導(dǎo)致光合速率下降的主要因素，那么光合速率的下降伴隨氣孔導(dǎo)度降低；如果光合速率的下降主要是由于非氣孔限制造成的，光合速率下降的同時(shí)將伴隨氣孔導(dǎo)度的上升。從本試驗(yàn)結(jié)果看，輕度干旱脅迫后，雖然Gs與Pn隨土壤含水量降低而變化方向一致，但Pn與Ci濃度變化方向相反，可認(rèn)為非氣孔限制是干旱脅迫苗木凈光合速率降低的主要原因，且非菌根化苗木比菌根化苗木受到干旱脅迫的傷害更大。

外生菌根真菌降低了苗木Tr，但處理間差異不顯著（P＞0.05）。Tr的降低可認(rèn)為是馬尾松苗木適應(yīng)干旱環(huán)境的一種表現(xiàn)。由此可見，馬尾松苗木主要通過增加Pn降低Tr和光合耗水量來提高水分利用效率，劉現(xiàn)剛等[34]在研究栓皮櫟Quercus variabilis苗木抗旱性時(shí)也得出類似結(jié)論。

3.3 明確了干旱脅迫下各菌種抗旱能力的強(qiáng)弱

干旱脅迫下各菌根化苗木抗旱指標(biāo)的主成分分析結(jié)果表明，馬尾松菌根化苗木主要通過增加光合利用效率，降低蒸騰失水，提高苗木水分含量，增強(qiáng)苗木抗旱性。對(duì)各菌根化苗木在干旱脅迫下的抗旱性強(qiáng)弱進(jìn)行了排序，其抗旱能力由強(qiáng)到弱為：S1＞T＞S7＞G＞C＞CK。