馬召穩(wěn)，李元曉，梁 含，王占彬，李 旺

（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界上栽培面積最大的豆科牧草，再生能力強(qiáng)，抗逆性好，生長(zhǎng)速度快，營(yíng)養(yǎng)豐富，有“飼草之王”的美稱[1]。當(dāng)前我國(guó)苜蓿產(chǎn)品主要以調(diào)制青干草為主，但調(diào)制干草的過程中因雨淋、落葉等因素使?fàn)I養(yǎng)成分損失較大[2-3]。青貯是保存青飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的有效方法。該方法是一個(gè)復(fù)雜的微生物區(qū)系變化過程，涉及到乳酸菌、腐敗菌、酵母菌、霉菌、芽胞桿菌等多種微生物[4]，這些微生物存在于青貯原料、青貯發(fā)酵過程中和發(fā)酵完成后等所有時(shí)期，并與青貯原料種類和青貯時(shí)期有很大關(guān)系[5-6]。其中乳酸菌是青貯發(fā)酵成功的關(guān)鍵微生物[7]。

微生物青貯添加劑可有效縮短青貯飼料制作時(shí)間，提升青貯飼料制作的成功率，提高青貯飼料品質(zhì)。目前主要使用的微生物菌種有乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、片球菌屬(Pediococcus)及部分芽孢桿菌屬(Bacillus)等。研究發(fā)現(xiàn)，利用枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和植物乳桿菌(L. plantarum)組合對(duì)玉米(Zea mays)進(jìn)行青貯，制作的青貯飼料品質(zhì)優(yōu)良[8]。添加凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans)、植物乳桿菌、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)和乳酸片球菌(P. acidilactici)的全株玉米青貯在感官評(píng)價(jià)上均優(yōu)于未添加微生物的自然發(fā)酵組[9]。

苜蓿青貯的制作要通過晾曬使水分降至65%左右制成半干青貯或者依靠青貯添加劑[10-13]。苜蓿青貯常用的微生物添加劑為乳酸菌，乳酸菌能夠利用發(fā)酵糖分產(chǎn)生乳酸，快速降低其pH，有效抑制霉菌等有害微生物的活動(dòng)，從而降低青貯飼料養(yǎng)分損失提高青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)[2,14]。王麗學(xué)等[15]利用5種乳酸菌對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行青貯發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌和乳酸片球菌能夠顯著提高青貯品質(zhì)。然而，有研究表明僅添加乳酸菌，能夠降低有氧穩(wěn)定性[16]，通過添加乳桿菌、地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)及不可培養(yǎng)酸桿菌對(duì)苜蓿進(jìn)行裹包青貯，發(fā)現(xiàn)3種菌劑能夠顯著提高苜蓿青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性[17]。由于青貯原料的差異，導(dǎo)致苜蓿青貯過程微生物種群變化情況存在很多未知。

隨著研究的深入，很多報(bào)道從基因水平研究青貯飼料微生物種群組成。徐振上[18]使用16S rDNA宏基因組技術(shù)對(duì)玉米青貯過程中細(xì)菌群落變化進(jìn)行分析，結(jié)果顯示厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteriodetes)三者占據(jù)了菌群的95%以上。本研究旨在通過分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)苜蓿青貯的微生物菌群進(jìn)行分析，篩選適合苜蓿青貯的微生物菌種，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，開發(fā)苜蓿青貯微生物添加劑，改善苜蓿青貯的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

苜蓿品種為阿爾岡金(Algonquin)，河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)翀?chǎng)種植第3年，春季第1茬，初花期刈割后在試驗(yàn)田晾曬24 h，用于苜蓿青貯制作。

培養(yǎng)基[19]有：MRS培養(yǎng)基[葡萄糖4 g，胰蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，牛肉膏2 g，MnSO4·4H2O 0.007 6 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，Tween-80 0.2 mL，K2HPO40.4 g，檸檬酸胺0.4 g (固體培養(yǎng)基加瓊脂粉3.2 g)，無菌水200 mL，pH 6.2～6.4]；LB培養(yǎng)基[胰蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，氯化鈉2 g (固體培養(yǎng)基加瓊脂粉3.2 g)，無菌水200 mL，pH 7.0～7.2]；NA培養(yǎng)基[牛肉膏0.6 g，蛋白胨2 g，氯化鈉1 g，無菌水200 mL (固體培養(yǎng)基加瓊脂粉3.2 g)，pH 7.2]；PDA培養(yǎng)基[去皮馬鈴薯40 g，加入200 mL無菌水煮沸20 min，雙層紗布過濾后補(bǔ)充水至200 mL，加入葡萄糖4 g (固體培養(yǎng)基加瓊脂粉3.2 g)，121 ℃高壓滅菌20 min，用乙醇溶解0.02 g氯霉素，加入培養(yǎng)基中]；麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基[葡萄糖0.2 g，氯化鉀0.36 g，酵母粉0.5 g，乙酸鈉1.64 g (固體培養(yǎng)基加瓊脂粉3.2 g)，蒸餾水200 mL]。

主要試劑：細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，生化試劑購(gòu)自TAKARA生物公司，其他化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自洛陽(yáng)博冠商貿(mào)有限公司。

采用通用引物[20]，上游：5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAC-3′，下游：5′-AAGGAGGTGATCCAG CC-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 苜蓿青貯的制作

將刈割的紫花苜蓿晾曬至水分含量為65%左右時(shí)，用剪刀剪成1 cm長(zhǎng)的小段，裝入500 mL廣口瓶中，壓實(shí)密封，厭氧發(fā)酵，制作3瓶，每瓶為1個(gè)重復(fù)。

1.2.2 苜蓿青貯品質(zhì)評(píng)定[21]

青貯第60天取樣，3個(gè)重復(fù)取樣后混合均勻，由具有青貯飼料質(zhì)量評(píng)估經(jīng)驗(yàn)的3人做現(xiàn)場(chǎng)感官評(píng)分，評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)參考《德國(guó)DLG青貯飼料感觀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)》[22]分為優(yōu)(20～16分)、良(15～10分)、中(9～5分)和下(4～0分) 4個(gè)等級(jí)。評(píng)分內(nèi)容為嗅覺、結(jié)構(gòu)和色澤：嗅覺分5個(gè)等級(jí)(0～14分)；結(jié)構(gòu)分4個(gè)等級(jí)(0～4分)；色澤分3個(gè)等級(jí)(0～2分)。

1.2.3 苜蓿青貯樣品宏基因組測(cè)序分析

由美因健康科技(北京)有限公司協(xié)助完成。

細(xì)菌基因組DNA的提取與質(zhì)量檢測(cè)：將苜蓿青貯3個(gè)重復(fù)各取3 g樣品混合均勻，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明進(jìn)行苜蓿青貯中細(xì)菌全基因組DNA的提取，利用Nanodrop檢測(cè)DNA的純度和濃度，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，然后利用Qubit3.0對(duì)DNA濃度進(jìn)行精確定量。

宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建及質(zhì)量檢測(cè)：使用Covaris超聲波破碎儀進(jìn)行隨機(jī)打斷，選取合適長(zhǎng)度的片段，經(jīng)過末端修復(fù)、3′端加A、加接頭、純化、擴(kuò)增等完成宏基因組文庫(kù)制備，文庫(kù)的質(zhì)量檢測(cè)為：用Qubit3.0對(duì)文庫(kù)初步定量并稀釋至1 ng·μL-1→Qsep100對(duì)文庫(kù)的Insert Size檢測(cè)→利用Q-PCR對(duì)文庫(kù)有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。宏基因組文庫(kù)質(zhì)檢合格后按照有效濃度和目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，測(cè)序策略為Illumina Hiseq，PE150。

測(cè)序完成后，對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制(Raw Data)、拼接組裝、基因預(yù)測(cè)并構(gòu)建非冗余基因集(gene catalogue)，然后對(duì)得到的基因進(jìn)行物種和功能上的注釋、分類以及豐度統(tǒng)計(jì)，在上述分析的基礎(chǔ)之上，對(duì)樣品或樣品組間進(jìn)行相似聚類，分組排序，差異比較等多方向的統(tǒng)計(jì)分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

1.2.4 微生物菌種的篩選

微生物的篩選方法參考文獻(xiàn)[7]的操作方法作進(jìn)一步優(yōu)化調(diào)整。在超凈臺(tái)中將10 g青貯樣品剪碎后放入90 mL無菌水混合于150 mL三角瓶中，封口膜封口，置于搖床上震蕩30 min，配置1 × 10-2、1 × 10-3、1 × 10-4共3種稀釋梯度，取50 μL稀釋液滴在MRS、NA、LB、PDA以及麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上，用涂布棒將菌液在培養(yǎng)基上涂抹均勻，然后將培養(yǎng)基倒轉(zhuǎn)靜置20～30 min，將MRS和麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基在37 ℃厭氧、NA、LB、PDA在37 ℃有氧條件下培養(yǎng)24～48 h，分離微生物。

1.2.5 微生物菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：對(duì)所篩菌種進(jìn)行純培養(yǎng)，分別在不同的固體培養(yǎng)基上，觀察菌落的形態(tài)、顏色、大小、光澤等菌落特征，用接種環(huán)分別挑取單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色[23]，顯微鏡下觀察菌體顏色、大小、形狀、是否有芽孢等菌體特征。

分子生物學(xué)鑒定：參照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書，提取所篩菌種基因組DNA，擴(kuò)增菌種的16S rDNA保守序列。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并通過NCBI Blast N進(jìn)行保守序列的分析比對(duì)。PCR擴(kuò)增體系為25 uL體系，包括：① 10 × Ex Taq buffer：2.5 μL，② dNTP：2 μL，③ 上游引物：1 μL，④ 下游 引物：1 μL，⑤ Ex Taq酶：0.5 μL，⑥ 模板(基因組DNA)：1 μL，⑦ ddH2O：17 μL。PCR反應(yīng)條件及程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 2 min→35個(gè)循環(huán)(變性94 ℃30 s→復(fù)性57 ℃ 30 s→延伸72 ℃ 1 min30 s)→終延伸72 ℃ 10 min→4 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿青貯質(zhì)量評(píng)定

對(duì)所制作的苜蓿青貯樣品進(jìn)行品質(zhì)評(píng)定，氣味評(píng)分10.78，結(jié)構(gòu)評(píng)分3.22，色澤評(píng)分1.56，綜合評(píng)分15.56，結(jié)果顯示，青貯品質(zhì)評(píng)定等級(jí)為良好。

2.2 苜蓿青貯中微生物種群分析

2.2.1 宏基因組文庫(kù)基因信息分析

通過構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，從苜蓿青貯樣品中篩選和組裝了60 710個(gè)基因樣品，通過測(cè)序得知這些基因總長(zhǎng)度為39 948 615 bp，平均長(zhǎng)度為720.04 bp，對(duì)其進(jìn)行了編號(hào)并計(jì)算了基因豐度信息。將這些基 因 在Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)與Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST(balst p)比對(duì)分析和功能注釋；經(jīng)過分析苜蓿青貯宏基因組中的基因主要涵蓋6大功能類：糖苷水解酶(glycoside hydrolases，GHs)、糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶(glycosyl transferases，GTs)、多糖裂合酶(polysaccharide lyases，PLs)、碳水化合物酯 酶(carbohydrate esterases，CEs)、輔 助 氧 化 還 原酶(auxiliary activities，AAs)和碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate-binding modules，CBMs)。

2.2.2 宏基因組文庫(kù)物種信息分析

圖 1 苜蓿青貯中微生物菌種群落分析Figure 1 Analysis of microbial communities in alfalfa silage

利用宏基因組測(cè)序技術(shù)擴(kuò)增苜蓿青貯中微生物保守序列，并對(duì)基因豐度在0.1%以上的基因序列進(jìn)行相似性分析和比對(duì)(圖1)?？梢钥闯?，相似性大于95%水平上的微生物物種共有53 587個(gè)，分屬18個(gè)門，28個(gè)綱，59個(gè)目，87個(gè)科，207個(gè)屬，672個(gè)微生物物種。厚壁菌門物種基因豐度可達(dá)99.4%，為主要優(yōu)勢(shì)微生物群落。序列測(cè)定基于目水平的分析，微生物群落數(shù)為51 822個(gè)，主要以芽孢桿菌目(Bacillales)和乳酸菌目(Lactobacillales)為主，分別占到目水平微生物群落總數(shù)的64.5%和18.9%?；趯俚乃娇煞治?，微生物群落總數(shù)為43 502個(gè)，其主要微生物群落為海洋桿菌屬(oceanobacillus)、乳桿菌屬(Lactobacilli)、芽孢桿菌屬(Bacilli)、枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)、乳酸球菌屬(Lactococcus)以及部分梭菌屬(clostridium)等。其所占比例分別達(dá)到了24.9%、14.3%、13.9%、13.2%、5.8%、4.1%。

在種的水平對(duì)苜蓿青貯微生物菌種分析，結(jié)果顯示芽孢桿菌菌種所占的比例較大，主要有枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、阿氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai)，短小芽孢桿菌(B. pumilus)以及尚未鑒定到種的部分芽孢桿菌屬菌株(Bacillussp.)。海洋桿菌屬的微生物菌種主要為O. damuensis及未鑒定到種的部分Oceanobacillussp.菌株。乳桿菌屬微生物菌種主要有植物乳桿菌及短乳桿菌(L. brevis)等。乳酸球菌屬的微生物菌種主要為乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和乳酸片球菌。腸球菌屬的菌株主要是糞腸球菌(E. faecalis)和屎腸球菌(E. faecium)。枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)的菌種主要為V. pantothenticus、V. halodenitrificans以及V. alimentarius等。

2.3 苜蓿青貯主要微生物菌種的篩選

利用MRS培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)的方式從苜蓿青貯中共篩選出13株菌株，暫命名為MRS1、MRS2、MRS3、MRS4、MRS5、MRS6、MRS7、MRS8、MRS9、MRS10、MRS11、MRS12、MRS13；利用麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基厭氧培養(yǎng)方式篩選出3株菌株，暫命名為MC1、MC2、MC3；PDA培養(yǎng)基好氧培養(yǎng)篩選出8株菌株，暫命名為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8；利用NA培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基好氧培養(yǎng)分別從苜蓿青貯中篩選出2株和4株菌株，暫命名為NA1、NA3和LB2、LB5、LB6、LB7。

2.4 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

2.4.1 菌株的菌落特征鑒定結(jié)果

從苜蓿青貯中分離出的菌株MRS1～13、MC1～3及NA1的菌落特征為圓形、邊緣整齊、表面光滑、中央凸起的乳白色單菌落(圖2A)。菌株P(guān)5、P8、LB2、LB5、LB6菌落表面不光滑，邊緣不整齊，中部有突起的皺褶(圖2B)。菌株P(guān)1～P4、P6、P7、LB7和NA3的菌落呈白色，邊緣不整齊，表面不光滑，有突起的皺褶(圖2C)。

2.4.2 菌株的菌體特征鑒定結(jié)果

從苜蓿青貯中分離出的菌株MRS1～9、MRS11、MRS12、MRS13、以及MC1、MC2、MC3革蘭氏染色結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性，短桿狀，單個(gè)或呈鏈狀排列(圖3A)。MRS10和NA1革蘭氏染色呈球形，單個(gè)或鏈狀排列的革蘭氏陽(yáng)性菌(圖3B)。菌株P(guān)DA1～8、LB7和NA3革蘭氏染色結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性、桿狀、單個(gè)或短鏈狀排列，芽孢中生或端生(圖3C)。

圖 2 苜蓿青貯中的部分菌株菌落特征Figure 2 Bacterial colonies in alfalfa silage

圖 3 苜蓿青貯中篩選出的部分菌株菌體Figure 3 Strains isolated from alfalfa silage

2.5 分子生物學(xué)鑒定

提取篩選到的微生物的基因組DNA，以每個(gè)菌種基因組DNA為模板，以細(xì)菌16S rDNA序列通用引物對(duì)其保守序列進(jìn)行擴(kuò)增(圖4)?？梢钥闯觯Y菌種均成功擴(kuò)增出大小約1 500 bp左右的DNA片段。對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行序列測(cè)定，將序列測(cè)定結(jié)果經(jīng)NCBI Blast N進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)菌株MRS1～MRS9和MRS11～MRS13以及MC1～MC3與植物乳桿菌(MG551233.1)的相似度達(dá)到了99.8%；菌株MRS10與乳酸片球菌菌株(KY550661.1)的相似度達(dá)到98.42%；菌株NA1與糞腸球菌(CP028727.1)的相似度達(dá)到了98.80%；菌株LB6與阿氏芽孢桿菌(KU052707.1)的相似度達(dá)到了99.44%；菌株P(guān)1～P4、P6、P7、LB7、NA3與枯草芽孢桿菌菌株(KC422328.1)相似度達(dá)到99.58%；菌株LB5、P5與地衣芽孢桿菌菌株(CP035404.1)的相似度達(dá)到了99.92%；菌株P(guān)8與短小芽孢桿菌菌株(KC692158.1)的相似度達(dá)到了99.55%。菌株LB2與解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)菌株(CP029071.1)的相似度達(dá)到了99.63%。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，初步確定從苜蓿青貯樣品中篩選到植物乳桿菌15株，乳酸片球菌和糞腸球菌各1株，各種芽孢桿菌12株。說明苜蓿青貯樣品中的微生物菌種以乳酸菌和芽孢桿菌為主。

3 討論與結(jié)論

本研究采用宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)苜蓿青貯中微生物菌落進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，厚壁菌門微生物的基因豐度高達(dá)99.4%，其中海洋桿菌屬、乳酸桿菌屬以及芽孢桿菌屬等基因豐度較大，與徐振上[18]在青貯玉米中微生物菌群分布的研究結(jié)果相似。但本研究在屬的水平分析的微生物物種與已有報(bào)道差異較大，可能的原因是青貯原料差別所引起，也可能與樣品開封后在氧氣中暴露的程度有關(guān)[6,24]。

在青貯飼料菌種篩選上，有報(bào)道從青貯玉米及苜蓿青貯中篩選出不同的微生物菌種。李旭嬌和玉柱[25]利用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法從苜蓿青貯飼料中篩選到4株植物乳桿菌。韓吉雨[26]通過對(duì)青貯發(fā)酵體系中乳酸菌多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，玉米青貯飼料在發(fā)酵第60天時(shí)篩選出的微生物有植物乳桿菌。張慧杰等[27]從阿爾岡金和敖漢兩個(gè)品種的紫花苜蓿青貯飼料中篩選到了乳酸片球菌。韓吉雨[26]篩選出的與乳酸片球菌特征一致的菌種，說明乳酸片球菌是苜蓿青貯的另一個(gè)主要菌種。除了乳酸菌之外，張濤[28]、席琳喬等[29]分別在苜蓿青貯和青貯玉米中篩選到地衣芽孢桿菌的近緣菌種。芽孢桿菌能夠產(chǎn)生具有抑制酵母和霉菌的細(xì)菌素，能夠顯著提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性[30]，并參與青貯飼料的整個(gè)發(fā)酵過程。

本研究篩選到植物乳桿菌15株，乳酸片球菌和糞腸球菌各1株，各種芽孢桿菌12株。與已有報(bào)道結(jié)果基本一致，說明乳酸菌和芽孢桿菌是青貯飼料的主要微生物菌種[25,28]。傳統(tǒng)微生物篩選方法不能完全獲得青貯飼料微生物種群的信息。本研究通過宏基因組測(cè)序分析了苜蓿青貯中的主要微生物類群，并通過配制相應(yīng)的培養(yǎng)基篩選到主要的微生物菌種，對(duì)微生物種屬的鑒定結(jié)果與宏基因組測(cè)序分析結(jié)果相一致。說明宏基因組測(cè)序技術(shù)能夠有效分析苜蓿青貯樣品中的微生物組成和種群信息，為篩選和使用苜蓿青貯中的微生物提供很大幫助。