許磊，汪子錚，牛亦博

(1.山西財(cái)經(jīng)大學(xué)體育學(xué)院，山西 太原030006；2. 山西省體育科學(xué)研究所，山西 太原030012；3.中國(guó)鐵路太原局集團(tuán)有限公司，山西 太原030009)

PM2.5是大氣污染主要來(lái)源，日漸受到研究者的重視?，F(xiàn)代研究表明，PM2.5暴露給機(jī)體帶來(lái)多器官的損傷，肝臟是重要的代謝器官，參與并維護(hù)機(jī)體的日常工作，對(duì)于肝臟損傷的進(jìn)一步研究得出，PM2.5可導(dǎo)致心臟和肝臟一定程度的氧化損傷[1]，同時(shí)PM2.5暴露會(huì)損害肝臟的葡萄糖代謝，會(huì)導(dǎo)致脾臟、肝臟出現(xiàn)炎癥損傷[2]。PPAR是配體活化型核轉(zhuǎn)錄因子，也是一種新的甾體激素類受體，參與免疫反應(yīng)和脂類代謝調(diào)控[3]。PPAR-γ具有調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞基因表達(dá)，糖、脂代謝平衡和胰島素細(xì)胞間信號(hào)傳遞等功能，在脂類代謝和機(jī)體內(nèi)環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中的主要調(diào)節(jié)者[4]。Kawakami等[5]于1982年發(fā)現(xiàn)脂肪組織腫瘤壞死因子(TNF-α)，該腫瘤壞死因子可抑制脂肪組織的蛋白合成[6]，同時(shí)該物質(zhì)能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒性[7]。肝臟是TNF-α的一個(gè)重要靶向器官，可促進(jìn)肝細(xì)胞壞死，同時(shí)可降低胰島素受體活性，增多游離脂肪酸(nonesterified fatty acid, NEFA)，并與細(xì)胞膜上受體結(jié)合，直接參與肝臟脂肪代謝，降低甘油三酯(triglyceride, TG)，增加胰島素抵抗[8]。本研究通過(guò)不同負(fù)荷游泳訓(xùn)練模式，結(jié)合肝臟的甘油三酯(triglyceride, TG)及NEFA數(shù)據(jù)，探討PM2.5暴露下運(yùn)動(dòng)大鼠肝臟蛋白表達(dá)功能，為PM2.5暴露環(huán)境下有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肝臟功能的影響提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

普通級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量230～260 g，由華阜康物生物科技股份有限責(zé)任公司(北京)提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2014-0004，檢疫合格。

1.2 試劑

甘油三酯(TG)測(cè)定試劑盒(100 管/96 樣)；游離脂肪酸(NEFA)測(cè)試盒(96T)；大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒；過(guò)化物酶體增殖物激活受體(PPAR-γ)Western blot檢測(cè)試劑盒。試劑盒全部購(gòu)置于南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及模型制備 將實(shí)驗(yàn)大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：PM2.5暴露組(E)、PM2.5暴露低負(fù)荷組(LES，負(fù)荷體質(zhì)量3%)、PM2.5暴露中負(fù)荷組(MES，負(fù)荷體質(zhì)量6%)、PM2.5暴露高負(fù)荷組(HES，負(fù)荷體質(zhì)量9%)。對(duì)運(yùn)動(dòng)組大鼠采用游泳訓(xùn)練方式9周，每周運(yùn)動(dòng)6 d，休息1 d，每次運(yùn)動(dòng)60 min。

1.3.2 標(biāo)本的采集 通過(guò)流量采樣器，高于水平面12 m左右，持續(xù)35 d采樣。

1.3.3 采用GPO-PAP法測(cè)定TG，微板法測(cè)定NEFA 甘油三酯(TG)測(cè)定試劑盒(100管/96樣)；游離脂肪酸(FFA)測(cè)試盒(96T)，測(cè)試全過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書完成。

1.3.4 大氣細(xì)顆粒物收集和染毒實(shí)驗(yàn) 使用流量采樣器，持續(xù)30 d/24 h。氣管滴注對(duì)動(dòng)物進(jìn)行染毒，每kg體質(zhì)量氣管滴注量為6 mg，染毒后游泳訓(xùn)練，期間禁食禁水。

1.3.5 ELISA法檢測(cè)大鼠肝臟勻漿中腫瘤壞死因子(TNF-α)表達(dá)水平 將冷凍大鼠肝臟組織融解至4 ℃，與PBS混合后使用勻漿器研磨勻漿，2 000～3 000 r/min，離心15 min左右，收集上清液，在提前稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品中加入樣品與生物素抗原工作液，輕搖后蓋上封板膜，放于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育55 min。3次洗滌之后，揭掉封板膜，先后加入顯色劑A、B，搖均后放于37 ℃避光顯色10 min。立刻以空白孔調(diào)零，測(cè)試吸光度，之后進(jìn)行計(jì)算得出數(shù)據(jù)。測(cè)試全過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書完成。

1.3.6 Western blot檢測(cè)過(guò)化物酶體增殖物激活受體(PPAR-γ)蛋白表達(dá) 隨機(jī)挑取大鼠肝臟組織2個(gè)，進(jìn)行蛋白提取，然后進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，顯示有陽(yáng)性條帶，之后開展正式實(shí)驗(yàn)。對(duì)大鼠肝臟提取組織蛋白，經(jīng)SDS-PAGE完成分離蛋白后將PPAR-γ通過(guò)濕式電轉(zhuǎn)印方法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；沖洗膜上剩余轉(zhuǎn)膜液，用巴斯特吸管吸盡洗滌液，加入封閉液，放于搖床上緩慢搖動(dòng)；按比例用封閉液稀釋一抗4 ℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次，加入二抗4 ℃緩慢搖動(dòng)孵育3 h，TBST洗膜3次；于暗室中將膜片平鋪，滴加ECL工作液使其將膜片完全覆蓋，孵育2～3 min，ECL發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，所用PPAR-γ的mRNA引物分別為美國(guó)Applied Biosystems 公司的Mm01135197_m1。目的基因的mRNA信號(hào)通過(guò)與核糖體18S RNA信號(hào)的比值為相對(duì)值，即可得到實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)定量值。測(cè)試全過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)采用SPSS19.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，各組均數(shù)間比較用ANOVA方法進(jìn)行檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PM2.5暴露及不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)肝臟NEFA及TG含量的影響

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，與暴露組相比，暴露中負(fù)荷組、暴露高負(fù)荷組肝臟TG含量明顯降低(P<0.05)，而暴露低負(fù)荷組與暴露組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；NEFA測(cè)試結(jié)果指出，同樣暴露中負(fù)荷組、暴露高負(fù)荷組肝臟TG含量明顯降低(P<0.05)，而暴露低負(fù)荷組于暴露組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

表1 PM2.5暴露及不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)肝臟NEFA及TG含量的影響(Mean±SD,n=10)1)Table 1 Effects of PM2.5 exposure and swimming exercise with different exercise loads on NEFA and TG content in liver(Mean±SD,n=10)

2.2 肝臟TNF-α含量

ELISA結(jié)果顯示，于暴露組相比，暴露中負(fù)荷組肝臟TNF-α含量明顯降低(P<0.01)，但暴露高負(fù)荷組的肝臟TNF-α含量高于暴露組(P<0.05)，而暴露低負(fù)荷組于暴露組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。通過(guò)不同負(fù)荷游泳訓(xùn)練大鼠肝臟TNF-α對(duì)比發(fā)現(xiàn)，暴露中負(fù)荷組對(duì)比暴露低負(fù)荷組，TNF-α含量顯著降低；而暴露高負(fù)荷組對(duì)比暴露低負(fù)荷組，TNF-α含量顯著升高。肝臟內(nèi)TNF-α含量的變化可能與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度有關(guān)，表明大強(qiáng)度負(fù)荷可增加體內(nèi)炎癥反應(yīng)，見圖1。

表2 PM2.5暴露及不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)肝臟TNF-α及PPAR-γ表達(dá)水平的影響(Mean±SD, n=10)1)Table 2 Effects of PM2.5 exposure and swimming exercise with different exercise loads on the expression of TNF-α and PPAR-γ in liver (Mean±SD, n=10)

圖1 不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)大鼠TNF-α含量的比較Fig.1 Comparison of TNF-α content in rats with different load exercise (Mean±SD, n=10)#P<0.05，##P<0.01 vs LES

2.3 肝臟PPAR-γ表達(dá)水平

Western blot結(jié)果如圖2所示。從左到右依次為暴露組、暴露低負(fù)荷組、暴露中負(fù)荷組以及暴露高負(fù)荷組，與暴露組相比，暴露低負(fù)荷組、暴露中負(fù)荷組肝臟PPAR-γ表達(dá)明顯升高(P<0.01)，于暴露組比較呈現(xiàn)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。通過(guò)不同負(fù)荷游泳訓(xùn)練大鼠肝臟PPAR-γ對(duì)比發(fā)現(xiàn)，暴露中負(fù)荷組對(duì)比暴露低負(fù)荷組，PPAR-γ表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而暴露高負(fù)荷組對(duì)比暴露中負(fù)荷組、暴露低負(fù)荷組，PPAR-γ含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而暴露中負(fù)荷組、暴露低負(fù)荷組之間無(wú)顯著性差異。提示隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度變化，肝臟內(nèi)PPAR-γ表達(dá)水平產(chǎn)生變化。其中，中等運(yùn)動(dòng)負(fù)荷組(MES)表達(dá)水平顯著增高，見圖3。

圖2 小鼠肝臟PPAR-γ的蛋白水平Fig.2 Protein level of mouse liver PPAR-γ

圖3 不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)大鼠PPAR-γ含量的比較Fig.3 Comparison of PPAR-γ content in rats with different load exercise (Mean±SD, n=10)#P<0.05，##P<0.01 vs E

3 討 論

TNF-α可直接反應(yīng)肝臟脂肪功能，可影響肝臟內(nèi)NEFA和TG的合成與分解。研究表明，TNF-α可以促進(jìn)肌肉與脂肪組織活動(dòng)，通過(guò)增加血漿的NEFA濃度增高肝臟指標(biāo)，同時(shí)增加肝臟TG合成，全過(guò)程是通過(guò)激素敏感性脂肪酶途徑增加肝臟脂肪變性的發(fā)生，TNF-α是重要的炎性因子，也發(fā)揮和調(diào)節(jié)炎性狀態(tài)下的脂質(zhì)代謝[9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，NASH模型動(dòng)物肝組織中TNF-α含量顯著增高[10]， TNF-α mRNA表達(dá)也顯著增加[11]。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)肝臟NEFA和TG指標(biāo)顯示，與PM2.5暴露組(E)對(duì)比，暴露中負(fù)荷組、暴露高負(fù)荷組均出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其中NEFA指標(biāo)暴露高負(fù)荷組顯著低于暴露組(P<0.01)。提示，通過(guò)有氧訓(xùn)練，可在一定范圍內(nèi)影響PM2.5暴露環(huán)境下肝臟脂肪功能代謝。

運(yùn)動(dòng)可改善肝臟脂肪代謝功能，影響細(xì)胞因子，提高抗氧化能力，前期研究發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度的功率車實(shí)驗(yàn)無(wú)法改變血漿TNF-α值，但高負(fù)荷強(qiáng)度可使TNF-α值顯著升高[12]。Vassilakopoulos實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)較大負(fù)荷強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可以引起血漿TNF-α升高[13]。大鼠實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)一次性力竭運(yùn)動(dòng)后，大鼠血清TNF-α含量顯著高于對(duì)照組[14]，9 W/90 min游泳訓(xùn)練，大鼠血清中TNF-α顯著高于對(duì)照組[15]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在PM2.5暴露環(huán)境下，與暴露組相比，暴露中負(fù)荷組、暴露高負(fù)荷組出現(xiàn)差異性(P<0.05)，暴露中負(fù)荷組降低，暴露高負(fù)荷組增高，暴露低負(fù)荷組無(wú)明顯變化，表明運(yùn)動(dòng)降低TNF-α表達(dá)而減輕炎癥性反應(yīng)；不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組對(duì)比顯示，暴露中負(fù)荷組低于其他負(fù)荷訓(xùn)練組(P<0.05)，表明中等負(fù)荷有氧訓(xùn)練，可有效降低大鼠肝臟TNF-α水平。這可能與運(yùn)動(dòng)時(shí)的脂肪消耗，動(dòng)員組織中細(xì)胞因子，增加激素分泌有關(guān)。這些與之前學(xué)者研究相對(duì)應(yīng)，運(yùn)動(dòng)可增白介素分泌，具有抗炎作用，進(jìn)而抑制TNF-α分泌，降低TNF-α水平[16]。還有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可能與腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)合成相關(guān)[17]。運(yùn)動(dòng)對(duì)炎癥狀態(tài)的減輕，可能是通過(guò)抑制TNF-α產(chǎn)生來(lái)完成的[18]。

PPAR-γ參與肝臟脂肪細(xì)胞分化和糖脂代謝，有著調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞基因表達(dá)及傳遞胰島素細(xì)胞間信號(hào)的重要作用[19]。對(duì)于肌纖維傳到信號(hào)而言，對(duì)肝星狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)化有重要作用，表現(xiàn)為從靜止表型向活化表型轉(zhuǎn)化[20]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與暴露組相比，參與運(yùn)動(dòng)的三組均有不同程度的提高，其中暴露低負(fù)荷組、暴露中負(fù)荷組對(duì)比暴露組出現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)，蛋白表達(dá)的提高可能是由于適宜負(fù)荷強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)影響肝臟脂肪代謝的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)脂肪組織TNF-α、PPAR-γ基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，引起肝臟糖代謝AKT蛋白表達(dá)變化，以此來(lái)進(jìn)一步改善肝臟糖耐量和胰島素抵抗[21]。在NAFLD大鼠實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步表明，通過(guò)12周有氧訓(xùn)練，對(duì)肝臟脂性改變PPAR-γ發(fā)揮更重要作用[22]。

運(yùn)動(dòng)可有效的抑制組織炎癥，減輕炎癥危害。研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ可抑制炎癥反應(yīng)，是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制炎癥信號(hào)通路和炎癥介質(zhì)的生成而發(fā)揮作用[23]。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究，TNF-α降低最為顯著的暴露中負(fù)荷組，PPAR-γ表達(dá)提高也最為顯著，這與前者研究相一致，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，8周耐力游泳運(yùn)動(dòng)可提高PPAR-γ蛋白表達(dá)，在大鼠脂肪組織中，進(jìn)一步誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞產(chǎn)生增殖與分化，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ蛋白表達(dá)程度與大鼠脂肪細(xì)胞的增殖與分化變化有關(guān)[24]。TNF-α是敏感的炎癥指標(biāo)之一，實(shí)驗(yàn)研究表明，TNF-α可減少PPAR-γ的產(chǎn)生及降低其mRNA的表達(dá)，有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)于胰島素抵抗的調(diào)節(jié)，可能是通過(guò)上調(diào)小鼠肝組織PPAR-γ mRNA的表達(dá)，反向增加PDH mRNA的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，大鼠通過(guò)游泳訓(xùn)練可以明顯改善胰島素抵抗，這可能與PPAR-γ表達(dá)的上調(diào)有關(guān)[25]。

總之，TNF-α與PPAR-γ在肝臟脂肪代謝中起到重要作用，參與調(diào)控肝內(nèi)脂肪酸氧化和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)。PM2.5暴露可損傷肝臟脂肪功能，而有氧運(yùn)動(dòng)在一定程度上可改善肝臟脂肪代謝。本研究制作PM2.5暴露下不同負(fù)荷游泳訓(xùn)練大鼠模型，探討研究在暴露環(huán)境下，不同負(fù)荷訓(xùn)練參與的肝臟脂肪代謝功能影響，為該環(huán)境下運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練提供理論基礎(chǔ)研究。