李浩東,徐 虹,范永新,劉 猛,朱月敏,馬俊平,欒 松

(涿州市醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,涿州 072750;*通訊作者,E-mail:drluansong@sina.com)

腦梗死又被稱為中風(fēng),是導(dǎo)致成人殘疾的主要原因,排在癌癥和心臟病之后成為全球死亡率第三的疾病[1]。腦梗死與多種危險因素相關(guān),包括高血壓和糖尿病等,其中高血壓對腦梗死的發(fā)生最有影響力[2]。因此,對于高血壓合并腦梗死的研究具有重要的意義。

自噬相關(guān)蛋白12(autophagy-related protein 12,ATG12)是一種參與自噬囊泡形成的泛素樣蛋白(ubiquitin-like protein),能夠通過調(diào)控自噬復(fù)合物的形成參與細(xì)胞的自噬和凋亡相關(guān)過程以及組織器官的損傷修復(fù)過程[3]。最近研究表明,在缺氧誘導(dǎo)的腦損傷模型中ATG12表達(dá)上調(diào),ATG12與缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)腦損傷的神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)[4]。我們推測ATG12可能影響卒中和高血壓的發(fā)生發(fā)展。本研究主要探索了ATG12與易卒中自發(fā)性高血壓大鼠血壓、大腦組織氧化應(yīng)激水平和自噬的關(guān)系,為高血壓合并腦梗死臨床治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性易卒中自發(fā)性高血壓(SHR/SP)大鼠30只,6-8周齡,體質(zhì)量(200±20)g,雄性WKY大鼠10只,6-8周齡,體質(zhì)量(200±20)g,均為SPF級,購于凱學(xué)生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號:37009200009107,由承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng),室溫(23±2)℃,相對濕度50%,光照時間和黑暗時間各12 h。

1.2 主要試劑

ATG12 shRNA腺相關(guān)病毒(ATG12 shRNA-AAV2)(漢恒生物科技有限公司),SOD檢測試劑盒和MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);ATG12引物和GAPDH引物(生工生物工程股份有限公司);LC3A/B兔單克隆抗體、p62兔單克隆抗體和ATG12兔單克隆抗體(美國CST公司);GAPDH兔單克隆抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.3 動物分組與造模

30只雄性SHR/SP大鼠隨機(jī)分為SHR/SP空白組(SHR/SP)、病毒對照SHR/SP組(NC shRNA SHR/SP)、ATG12干擾組(ATG12 shRNA SHR/SP),每組10只。10只雄性WKY大鼠為WKY對照組(WKY)。ATG12干擾大鼠模型的建立:ATG12干擾組(ATG12 shRNA SHR/SP)大鼠尾靜脈注射ATG12 shRNA腺相關(guān)病毒(病毒對照SHR/SP組大鼠注射NC對照腺相關(guān)病毒),滴度為2.0×1011gene copies/ml,稀釋成100 μl進(jìn)行尾靜脈注射,注射2周,然后檢測大鼠大腦組織ATG12的表達(dá)水平。

1.4 大鼠血壓的測定

采用無創(chuàng)尾動脈測壓儀分別測定SHR/SP空白組、病毒對照組和ATG12干擾組大鼠和WKY大鼠血壓。將安靜狀態(tài)下的大鼠放入大鼠固定儀，將鼠尾套入無創(chuàng)血壓測量儀，37 ℃預(yù)熱10-15 min，測定并記錄各組大鼠尾動脈血壓。每只大鼠重復(fù)測量3次，取其平均值。實(shí)驗(yàn)取收縮壓為檢測指標(biāo)，以mmHg表示。

1.5 熒光定量PCR檢測ATG12基因表達(dá)

脫頸處死大鼠,迅速分離大腦組織,Tizol法提取組織總RNA,按照說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以獲得反應(yīng)體系的cDNA模板,采用兩步法進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng),具體反應(yīng)條件如下:95 ℃ 30 s預(yù)變性;95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,根據(jù)Ct值計算大鼠大腦組織的ATG12基因相對表達(dá)量。熒光定量PCR引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

Table 1 The primer sequence for real-time PCR

名稱序列(5′-3′) ATG12F:TCTTAGACTGCTGTGCCTGCR:AACTTGTTTGACGCCTTCGCGAPDHF:AGAAGGCTGGGGCTCATTTGR:AGGGGCCATCCACAGTCTTC

1.6 組織抗氧化水平的檢測

如1.3處理大鼠,然后迅速分離大鼠新鮮大腦組織,冰上碾磨成懸液。按照SOD和MDA檢測試劑盒操作手冊,檢測各組大鼠大腦組織中SOD和MDA的含量。

1.7 大腦組織蛋白表達(dá)的檢測

取大鼠大腦組織置于冰上碾磨勻漿，裂解細(xì)胞并測定蛋白濃度，取總蛋白(40 μg)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉液封閉1 h，分別加入1∶300稀釋的一抗(LC3A/B，p62，ATG12,GAPDH)，4 ℃孵育過夜。加入1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育45 min，洗滌后加入顯色液顯色拍照，用ImageJ2x軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ATG12在SHR/SP大鼠中高表達(dá)

首先檢測ATG12在SHR/SP大鼠中的表達(dá)水平,qRT-PCR結(jié)果顯示,與WKY大鼠相比,SHR/SP大鼠大腦組織ATG12的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01,見圖1)。

與WKY大鼠比較，**P<0.01

2.2 ATG12對SHR/SP大鼠血壓的影響

與WKY大鼠組比較,SHR/SP組大鼠血壓顯著升高(P<0.01)。與NC shRNA SHR/SP組比較,ATG12 shRNA SHR/SP組大鼠血壓顯著降低(P<0.01,見圖2)。

與WKY組比較，**P<0.01;與NC shRNA組比較，##P<0.01

2.3 ATG12對SHR/SP大鼠大腦組織氧化應(yīng)激水平的影響

結(jié)果顯示,與WKY大鼠組比較,SHR/SP組大鼠大腦組織SOD活力顯著降低,MDA含量顯著升高(P<0.01)。與NC shRNA SHR/SP組比較,ATG12 shRNA SHR/SP組大鼠大腦組織SOD活力顯著升高,MDA含量顯著降低(P<0.01,見圖3)。

與WKY組比較，**P<0.01;與NC shRNA組比較，##P<0.01

2.4 ATG12對SHR/SP大鼠大腦組織自噬水平的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示,與WKY大鼠組比較,SHR/SP組大鼠大腦組織LC-3A/B蛋白表達(dá)水平顯著升高,P62蛋白水平顯著降低(P<0.01)。與NC shRNA SHR/SP組比較,ATG12 shRNA SHR/SP組大鼠大腦組織LC-3A/B蛋白表達(dá)水平顯著降低,P62蛋白水平顯著升高(P<0.01,見圖4)。

與WKY組比較，**P<0.01;與NC shRNA組比較，##P<0.01

3 討論

流行病學(xué)研究表明,全球每年約有1 500萬人成為腦梗死的受害者,其中500萬人在診斷后1年內(nèi)死亡,另有500萬人將永久殘疾。一旦發(fā)生腦梗死,有效的治療方法非常有限[5]。因此,預(yù)防被認(rèn)為是遏制腦梗死大流行的最有效策略。研究與腦梗死發(fā)生相關(guān)的基因,對于腦梗死的預(yù)防具有重要的意義。

由氧化劑生成和抗氧化防御之間的不平衡引起的氧化應(yīng)激在腦老化、神經(jīng)退行性疾病和腦梗死的發(fā)生中起重要作用[6]。與其他組織相比,大腦的氧氣消耗量更大,抗氧化能力更強(qiáng),這使得氧化應(yīng)激可能成為腦梗死的原因[7]。SOD酶活性是評估臨床中抗氧化活性的有用工具。機(jī)體在外界有害條件的刺激下,體內(nèi)氧化平衡被打亂,SOD等抗氧化酶表達(dá)減少,導(dǎo)致ROS積累增多,機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。MDA是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,MDA水平與缺血性卒中的大小和臨床結(jié)果相關(guān)[8]。

本研究檢測了高血壓合并腦梗死對大鼠大腦組織氧化應(yīng)激水平的影響,結(jié)果顯示,SHR/SP組大鼠大腦組織SOD活性顯著降低,MDA水平升高,表明腦梗死與機(jī)體氧化應(yīng)激有關(guān),這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致。抑制ATG12表達(dá)能夠提高腦早衰大鼠大腦組織SOD活性,抑制MDA水平,證實(shí)提高機(jī)體抗氧化能力并抑制機(jī)體氧化應(yīng)激水平,能夠緩解腦梗死的發(fā)生,這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致。

ATG12(autophagy-related protein 12)也叫自噬相關(guān)蛋白12,是由ATG12基因編碼的與細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)的重要蛋白[9]。ATG12是參與自噬的酵母蛋白的人類同源物。ATG12與ATG5通過泛素樣共軛系統(tǒng)形成共價連接,ATG12-ATG5復(fù)合體能夠進(jìn)一步促進(jìn)ATG8與脂質(zhì)磷脂酰乙醇胺的結(jié)合,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬[10]。有研究顯示,ATG12參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,該蛋白通過與Bcl-2家族的抗凋亡成員的相互作用抑制抗凋亡蛋白的活性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[11]。

自噬是受損或功能失調(diào)的細(xì)胞質(zhì)組分的降解和再循環(huán)過程[12]。LC3又叫自噬相關(guān)蛋白,是自噬標(biāo)志物,自噬形成時,胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)會酶解掉一小段多肽,轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-Ⅱ),LC3-Ⅱ/Ⅰ值反應(yīng)自噬水平的高低。P62是自噬的選擇性底物之一,在自噬的過程中被降解,含量顯著降低[13,14]。近幾年來,自噬被認(rèn)為是腦損傷病理學(xué)變化。腦梗死引起自噬過度激活,對組織器官產(chǎn)生損傷。國外研究表明,在腦梗死過程中,大腦組織自噬水平顯著升高[12,15]。

本次研究探索了自噬水平與易卒中高血壓的關(guān)系,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與WKY大鼠相比,SHR/SP組大鼠大腦組織中LC3的表達(dá)水平顯著升高,P62的表達(dá)水平顯著降低。揭示大腦組織的自噬水平與易卒中高血壓的發(fā)生有關(guān)。抑制ATG12的表達(dá)水平能夠抑制LC3表達(dá),促進(jìn)P62的蛋白表達(dá),抑制了大腦組織自噬水平,可緩解高血壓的發(fā)生。本研究僅證實(shí)了抑制ATG12的表達(dá)水平能夠抑制易卒中高血壓和大腦組織自噬水平,而上調(diào)ATG12是否會促進(jìn)卒中和高血壓的發(fā)生以及ATG12通過自噬通路如何緩解易卒中高血壓還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證明。

總之,本研究通過SHR/SP大鼠建立了ATG12低表達(dá)SHR/SP大鼠模型,對ATG12與SHR/SP大鼠血壓、大腦組織氧化應(yīng)激和自噬之間的關(guān)系進(jìn)行探索,為ATG12在腦梗死的發(fā)生和預(yù)防中的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。