王宇光 王 軍 段瑞軍 覃和業(yè) 梅文莉 戴好富

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省沉香工程技術(shù)研究中心 海南?？?71101)

沉香藥用價(jià)值較高，被廣泛應(yīng)用于消化、呼吸、心腦血管、風(fēng)濕等疾病的治療［1-2］。沉香還是一種香料，在中東國(guó)家，沉香精油、香水備受推崇。此外，沉香的文化收藏價(jià)值也較高。世界沉香及產(chǎn)品每年的貿(mào)易額達(dá)200億元以上，且呈逐年增加之勢(shì)。

白 木 香 ［Aquilariasinensis（Lour.）Spreng.］是中國(guó)生產(chǎn)沉香的唯一基源植物，人工規(guī)模栽培已有40 a歷史，但對(duì)其遺傳資源的系統(tǒng)評(píng)價(jià)和選育尚未開展，種苗培育所用種子大多來(lái)自栽培或野生成齡植株，種質(zhì)參差不齊［3］。因此，研究沉香優(yōu)良品種的選育和繁育技術(shù)具有重要的意義。種子后代為有性系，而通過(guò)組培、扦插和嫁接等方式生產(chǎn)的種苗為無(wú)性系，其性狀不會(huì)發(fā)生分離。白木香是較難生根植物，無(wú)論組培［4-6］還是扦插［7-8］，生根率均較低，嫁接技術(shù)因可以克服生根困難，成為解決沉香種苗繁育的最佳途徑［9-10］。前人已篩選和鑒定了優(yōu)良白木香母樹，通過(guò)嫁接可實(shí)現(xiàn)該母樹的無(wú)性系化，經(jīng)多地區(qū)種植，利用GC-MS技術(shù)分析檢測(cè)所產(chǎn)沉香，發(fā)現(xiàn)嫁接無(wú)性系和母樹具有相同的優(yōu)良特性，即所產(chǎn)沉香所含的沉香特征性成分相對(duì)百分含量較高，總色酮相對(duì)百分含量平均為81.50%，其中，2-（2-苯乙基）色酮、2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮、2-［2-（3-羥基-4-甲氧基苯）乙基］色酮和2-［2-（3-甲氧基-4-羥基苯）乙基］色酮的相對(duì)百分含量之和平均為77.00%，2-（2-苯乙基）色酮和2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮的相對(duì)百分含量之和平均為51.25%，比普通白木香所產(chǎn)沉香相關(guān)成分的相對(duì)百分含量顯著提高，具有‘奇楠’沉香的化學(xué)成分特征［11-13］?！骈料闶菢I(yè)界公認(rèn)的最優(yōu)質(zhì)沉香。因此，上述嫁接的無(wú)性系被認(rèn)為是一種白木香優(yōu)良無(wú)性系，將其命名為‘熱科2號(hào)’，2017年獲得海南省林木品種委員會(huì)認(rèn)定（良種編號(hào)：瓊R-ETS-AS-003-2017）。為進(jìn)一步推廣，開展白木香‘熱科2號(hào)’嫁接苗擴(kuò)大生產(chǎn)的研究，驗(yàn)證‘熱科2號(hào)’在遺傳上的獨(dú)立性及第一代嫁接苗和母樹在遺傳上的一致性，避免由于某些失誤導(dǎo)致種質(zhì)間的混淆。同時(shí)，在采用第一代嫁接苗作為芽條進(jìn)一步擴(kuò)繁之前，采用基因組單堿基多態(tài)性 （single nucleotide polymorphisms， SNPs）技術(shù)［14-15］對(duì)‘熱科2號(hào)’進(jìn)行基因分型。

前人多使用枝接（穗接）擴(kuò)繁白木香，即直接從野外采集自然生長(zhǎng)的土沉香穗來(lái)進(jìn)行嫁接，成活率平均為15.00%［9］。人工種植白木香植株可通過(guò)砍枝促萌管理，用1 a生枝條進(jìn)行嫁接，顯著提高白木香嫁接成活率，平均為56.80%（最高為84.00%）［10］。由此可見，優(yōu)化砧木和芽條生長(zhǎng)狀況可提高白木香嫁接成活率。目前，尚未見芽接應(yīng)用在白木香嫁接苗擴(kuò)繁，但該方法在橡膠樹等大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化林木無(wú)性系生產(chǎn)上應(yīng)用較為成熟，成活率也較高［16-17］，因其具備諸多優(yōu)勢(shì)，如對(duì)嫁接季節(jié)要求不嚴(yán)格，不浪費(fèi)砧木，繁殖數(shù)量大，對(duì)推廣良種極為有利［18］。因此，有必要開展‘熱科2號(hào)’的芽接擴(kuò)繁技術(shù)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

‘熱科2號(hào)’嫁接苗繁育試驗(yàn)地點(diǎn)：海南省文昌市邁號(hào)鎮(zhèn)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基地。該地為熱帶氣候，每年最低溫高于3℃，不出現(xiàn)明顯霜凍。

‘熱科2號(hào)’第一代嫁接苗由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所2013年擴(kuò)繁所得。

砧木為白木香種子苗，包括來(lái)自廣東化州地區(qū)、海南中部地區(qū)（瓊中）和海南南部地區(qū)（保亭）的白木香種子苗，用塑料營(yíng)養(yǎng)袋培育，營(yíng)養(yǎng)袋規(guī)格為17 cm×19 cm。

白木香基因組的單堿基多態(tài)性（SNP）分析由北京百邁客生物科技有限公司協(xié)助完成。

1.2 方法

1.2.1 白木香‘熱科2號(hào)’SNP基因分型

參考Sun等［19］方法，通過(guò)開發(fā)白木香全基因組SNP標(biāo)記，應(yīng)用于白木香的分型。從廣東白木香種群A取27個(gè)樣本（A1，A3，A4，A7，A11，A12，A19， A20， A26， A28， A29， A30， A32， A34，A35， A37， A40， A42， A48， A51， A54， A56，A59，A60， A100， A101，A102）；海南白木香種群C取11個(gè)樣本（C1～C11）；‘熱科2號(hào)’母樹和第一代嫁接無(wú)性系樣本B取5個(gè)樣本（B2，B3，B4，B5，B6），其中B6為‘熱科2號(hào)’母樹，B2、B3、B4、B5為‘熱科2號(hào)’嫁接苗。另外，B7、B1為砧木，作為對(duì)照。樣本分別為各植株葉片，置離心管于液氮中保存。樣品總基因組DNA采用試劑盒（SolarBio）提取，每樣品的DNA總量為1.5μg，濃度≥20ng/μL，純度OD 260/280為 1.8～2.2。采用RsaI＋HaeIII對(duì)45個(gè)樣品DNA分別酶切［20］，于 37 ℃用 Klenow fragment （3→5'exo-）（NEB）和dATP對(duì)酶切片段進(jìn)行加A處理。用T4連接酶對(duì)帶有A尾的酶切片段連接測(cè)序接頭［21］。以連接測(cè)序接頭后的DNA片段為模板，用引物（5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3'，5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后切下長(zhǎng)度在364～414 bp片段，純化得到SLAF標(biāo)簽庫(kù)［19］。上機(jī)測(cè)序，分別得到各自讀段［22］。根據(jù)讀段序列的相似度，進(jìn)行聚類，聚類到一起的讀段來(lái)源于一個(gè)SLAF F標(biāo)簽。一個(gè)SLAF在不同樣品間序列可能完全相同（沒(méi)有多態(tài)性），也可能相互之間有變異（包括插入/缺失變異、單堿基變異），稱為多態(tài)性SLAF序列。單堿基變異造成的SLAF多態(tài)性即為SNP。以每個(gè)SLAF標(biāo)簽中測(cè)序深度最高的序列類型作為參考序列，利用bwa［23］將各個(gè)樣品測(cè)序得到的讀段比對(duì)到參考基因組（Aquilaria agallochum基因組）（下載地址：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/32033？genomeassembly id=202302） 上，并使用 GATK［24］和 samtools［25］2種方法開發(fā)SNP，以2種方法得到的SNP標(biāo)記交集作為最終SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)集。

白木香種群的分型和進(jìn)化關(guān)系：對(duì)所有的SNP根據(jù)完整度＞0.5，MAF＞0.05過(guò)濾。運(yùn)用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對(duì)45份白木香完成群體進(jìn)化樹分析，從基因組水平揭示不同群體之間的遺傳分化關(guān)系［26］。

1.2.2‘熱科2號(hào)’嫁接苗生產(chǎn)

‘熱科2號(hào)’第一代嫁接苗按2 m×2 m行距種植在黃壤土（pH6.5）。每周采用塑料噴灌帶給水1次，保持土壤濕度。每株種植時(shí)施有機(jī)肥4 kg。后續(xù)每月補(bǔ)施復(fù)合肥1次，10 g/株。每2個(gè)月分別用80%的代森錳鋅可濕性粉劑稀釋700倍液噴灑整個(gè)植株預(yù)防炭疽病，用90%的敵百蟲稀釋1 000倍液噴灑葉片控制黃野螟、青蟲、卷葉蟲等蟲害。

‘熱科2號(hào)’母樹第一代嫁接苗于2014年6月基地種植后，2016年5月主干生長(zhǎng)至約1.8 m高，去頂。2017年6月取1 a生枝條進(jìn)行嫁接，修剪植株。新長(zhǎng)出的枝條在較好的肥水和病蟲害管理下，次年春天隨著溫度升高（平均溫度25℃以上）進(jìn)入良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，5月后可再次用于嫁接。以后每年取芽條嫁接時(shí)對(duì)植株進(jìn)行相同的修剪。

嫁接前4個(gè)月，將2.5 a生樹體健壯、無(wú)病蟲害的白木香種子容器苗（塑料營(yíng)養(yǎng)袋規(guī)格為17 cm×19 cm，地徑≥1.5 cm，苗高≥110 cm）移植在苗床上，株行距20 cm×20 cm，每2行留40 cm寬行道作為嫁接操作所用，并用紅壤土將營(yíng)養(yǎng)袋覆蓋。每0.5個(gè)月施復(fù)合肥1次，7 g/株。經(jīng)過(guò)4個(gè)月生長(zhǎng)，可用于嫁接。

5～10月，選擇1.0～1.5 a生芽條，切下包含有效芽點(diǎn)的芽片，去除木質(zhì)部，剪成“盾形”。在砧木距地面7 cm處地徑一面切成“U”，撥除砧木皮層，插入芽片，用塑料帶綁緊。30 d后將綁縛解除。65 d后將嫁接成活苗的砧木鋸頂，催芽。

1.2.3 對(duì)照芽條植株和砧木的培養(yǎng)

作為對(duì)照，部分‘熱科2號(hào)’植株和海南中部地區(qū)的白木香種子苗在嫁接前6個(gè)月自然生長(zhǎng)，即不人工給水和施肥、不使用農(nóng)藥。由于試驗(yàn)區(qū)比較干旱，所用土壤為深挖紅壤土，較貧瘠，因此，芽條和砧木植株基本生長(zhǎng)在脅迫型的環(huán)境中。

1.2.4 不同處理對(duì)嫁接成活率的影響

分別取海南瓊中產(chǎn)的白木香種子苗3 000株（I組）、廣東化州產(chǎn)白木香種子苗900株（II組）和海南保亭產(chǎn)的白木香種子苗3 000株（III組）為砧木，以‘熱科2號(hào)’嫁接苗植株1.0～1.5 a生枝條為芽條，分別于2017年6月、2018年6月和2018年9月進(jìn)行嫁接，I組和III組每次嫁接1 000株，II組每次嫁接300株。同時(shí)取1.2.3條件下生長(zhǎng)的砧木和芽條分3次進(jìn)行嫁接（IV組），每次砧木200株，作為對(duì)照。嫁接30 d后去除薄膜，檢查嫁接的芽片是否保持綠色，如為綠色，即認(rèn)定為成活。

采用Excel和SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)不同處理獲得的芽片嫁接成活率進(jìn)行差異顯著性分析。

砧木鋸頂后設(shè)置3組試驗(yàn)。A組：將苗床上的全部砧木植株做鋸頂處理。保持土壤濕潤(rùn)，繼續(xù)培養(yǎng)4個(gè)月，計(jì)算芽片的抽芽率；B組：將苗床部分嫁接成活芽片的砧木植株做鋸頂處理；C組：取芽接成活的砧木植株做鋸頂處理，并從營(yíng)養(yǎng)袋底下斷根，移植空地苗床，并用紅壤土將營(yíng)養(yǎng)袋覆蓋。使用遮光率45%的遮陽(yáng)網(wǎng)遮蔭培養(yǎng)1個(gè)月后拆掉遮陽(yáng)網(wǎng)。為了避免鋸頂處理造成砧木死亡，以上鋸頂?shù)姆椒ㄊ菑恼枘久绺叩?5%～40%位置鋸斷，并用油漆涂布切口，其后通過(guò)抹掉不定芽的方式誘導(dǎo)嫁接成活芽片抽芽。每組處理重復(fù)3次，分別于2017年10月15日（每組100株）、2018年10月20日（每組400株）和2018年11月5日（每組400株）進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 白木香‘熱科2號(hào)’的基因分型

通過(guò) SLAF-seq（specific-locus amplified fragment sequencing）技術(shù)共開發(fā)了328 377個(gè)SLAF標(biāo)簽，共得到585 503個(gè)群體SNP。通過(guò)MEGA6［26］軟件，構(gòu)建樣品的群體進(jìn)化樹，如圖1所示。

由圖1可知，通過(guò)SNP標(biāo)記，A、B、C 3個(gè)白木香種群能很好地分開，而且A種群27個(gè)個(gè)體被分為4個(gè)亞群，表現(xiàn)出豐富的多樣性。B種群為白木香‘熱科2號(hào)’第一代嫁接苗和母樹，被集聚在同一特異分支上，很好地與其它種群（A、C種群）分開，說(shuō)明是一個(gè)群體遺傳上相對(duì)獨(dú)立的品系。B1、B7為砧木，作為對(duì)照，也能與白木香優(yōu)良嫁接無(wú)性系‘熱科2號(hào)’很好地分開，從而說(shuō)明利用SNP分型的準(zhǔn)確性。比較A、B、C3個(gè)白木香種群不同個(gè)體間的遺傳距離，發(fā)現(xiàn)B種群個(gè)體間的遺傳距離最短。A、C種群的不同個(gè)體為同一家系或自然群體樣品，遺傳距離比作為嫁接無(wú)性系的B種群個(gè)體間的遺傳距離長(zhǎng)，反映了樣品的實(shí)際情況。

圖1 白木香‘熱科2號(hào)’系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 不同方法培養(yǎng)的芽條和砧木對(duì)芽片嫁接成活率的影響

由表1可知，I、II、III組芽片嫁接成活率比較高，平均達(dá)90.31%，IV組芽片嫁接成活率比較低，平均為25.50%。I、II、III組和IV組間的芽片嫁接成活率差異顯著，可見芽條和砧木的培養(yǎng)方法對(duì)芽接成活率有重要影響?？赡苁怯捎贗、II、III組芽條和砧木在良好的水肥及充足的光照條件，嚴(yán)格的病蟲害控制下培養(yǎng)，處在良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，形成層較厚，易剝開，纖維化程度低，白中帶綠，水分充足，因此，有利于芽接成活。反之，IV組芽條和砧木于脅迫型環(huán)境條件下生長(zhǎng)，形成層較薄，不易剝開，纖維化程度高，缺乏水分，因而不利于芽接成活。

由表1可知，不同地域的白木香種子苗作為砧木，對(duì)芽接成活率無(wú)顯著性差異。雖然來(lái)自廣東化州的砧木和來(lái)自海南的砧木在SNP基因分型中（圖1）被聚類在不相同的分支，為不同地域白木香種群，但遺傳差異沒(méi)有顯著影響芽接成活率。

表1 不同方法培養(yǎng)的芽條和砧木對(duì)芽片嫁接成活率的影響

2.3 砧木鋸頂后不同生長(zhǎng)條件對(duì)嫁接成活芽片抽芽率的影響

由表2可知，不同處理間芽片發(fā)芽率存在較大差異。A組被鋸頂?shù)闹仓甑玫匠浞止庹眨瑫r(shí)不被傷根，平均出芽率最高，為80.00%；B組由于被大量的其他未鋸頂植株遮陰，被鋸頂?shù)闹仓旯庹諊?yán)重不足，出芽率僅10.25%，C組通過(guò)移植方式保證被鋸頂?shù)闹仓甑玫匠浞止庹眨@得較高的出芽率，為69.17%，但移植傷根在一定程度上降低芽片發(fā)芽率。因此，提高芽片發(fā)芽率可在砧木預(yù)培養(yǎng)時(shí)擴(kuò)大間距，一次性全部嫁接芽片。由于芽片嫁接成活率較高，可全部一次鋸頂。同時(shí)可將少部分未嫁接成活植株移植其它苗床，保證被鋸頂?shù)闹仓甑玫匠浞值墓庹眨岣哐科l(fā)芽率。

表2 砧木鋸頂后不同生長(zhǎng)條件對(duì)嫁接成活芽片的抽芽率的影響

3 討論

白木香良種‘熱科2號(hào)’在形態(tài)上和普通白木香無(wú)明顯差異，但白木香SNP分型結(jié)果能區(qū)分‘熱科2號(hào)’和來(lái)自海南和廣東的白木香種群。‘熱科2號(hào)’所產(chǎn)沉香的化學(xué)成份特征突出，品質(zhì)優(yōu)良，說(shuō)明‘熱科2號(hào)’是一個(gè)獨(dú)特的優(yōu)良品種，有必要擴(kuò)大嫁接無(wú)性系生產(chǎn)。此外，SNP分型結(jié)果證實(shí)了‘熱科2號(hào)’第一代嫁接苗和母樹之間的關(guān)系，為選擇第一代嫁接苗作為‘熱科2號(hào)’嫁接苗生產(chǎn)的芽條植株提供了分子依據(jù)。

提高嫁接成活率直接影響生產(chǎn)的效率和成本。影響嫁接成活率的因素主要包括［10，27-28］：（1） 嫁接方法；（2）不同品系的砧木；（3）氣候因子（溫度、濕度等）；（4）砧木和芽條生長(zhǎng)狀況。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同白木香品系的砧木對(duì)嫁接成活率無(wú)顯著影響，但砧木和芽條生長(zhǎng)狀況卻有顯著影響。

嫁接芽片需經(jīng)歷幾個(gè)階段才能夠成活：（1）前期，芽片在薄膜密封的環(huán)境中，避免失水；（2）芽片和砧木之間逐漸形成維管束橋［29］；（3）芽片和砧木之間形成愈傷組織［30-32］；（4）嫁接口愈傷組織逐漸木質(zhì)化，形成維管束［31-33］；（5）芽片上腋芽萌發(fā)。芽片和砧木之間形成維管束橋之前，由于缺乏物質(zhì)交換的通道，芽片無(wú)法從砧木汲取養(yǎng)分，此時(shí)芽片形成愈傷組織所要求的養(yǎng)分全部由自身提供［34］，因此，芽片原有營(yíng)養(yǎng)積累對(duì)嫁接成活有著重要作用。此外，有助于芽片和砧木間形成愈傷組織的其它因子（如植物激素）也影響嫁接成活率。

有研究表明，干旱脅迫對(duì)蘋果砧木葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)和抗氧化系統(tǒng)有顯著影響，抑制通過(guò)光合作用合成碳水化合物［35］。碳水化合物是愈傷組織形成的能量基礎(chǔ)［36］。在優(yōu)化條件下生長(zhǎng)的白木香植株光合效率較高，積累的碳水化合物等養(yǎng)分較為豐富。相反，在干旱等脅迫條件下生長(zhǎng)的白木香植株光合效率降低，積累的碳水化合物等養(yǎng)分較為貧乏。這可能是導(dǎo)致不同條件下培養(yǎng)的白木香芽條和砧木嫁接成活率有顯著差異的原因之一。

外源生長(zhǎng)素（auxin，IAA）能提高嫁接口處維管束橋形成的速率及數(shù)目，促進(jìn)愈傷組織的形成［37-39］。IAA能夠促進(jìn)黃瓜/番茄嫁接嫁接口形成層的活動(dòng)，從而產(chǎn)生大量愈傷組織，形成維管束橋，提高嫁接苗成活率［39］。說(shuō)明芽條和砧木內(nèi)源IAA也有利于提高嫁接成活率。植物激素主要包括脫落酸（abscisic acid，ABA）、赤霉素（gibberellin，GA）和生長(zhǎng)素（IAA）。在干旱脅迫下，植物激素響應(yīng)一般是上調(diào)ABA相對(duì)含量，下調(diào)IAA相對(duì)含量，總體上IAA/ABA下降，而ABA/IAA上升［40－41］，不利于嫁接口愈傷組織的形成。這可能是干旱等脅迫條件生長(zhǎng)的白木香芽條和砧木用于嫁接的成活率不高的另一原因。

金花茶頂芽從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換過(guò)程中，ABA/GAs、ZRs/GAs和ABA/IAA逐漸提高，而IAA/ABA下降［42］。其它植物枝條在從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換過(guò)程，IAA/ABA會(huì)發(fā)生類似變化，分配到生殖構(gòu)件中的生物量逐漸增多［43-44］，從而消耗積累的養(yǎng)分。因此，開花結(jié)果的白木香枝條作為芽條，嫁接成活率會(huì)降低，白木香優(yōu)良無(wú)性系枝條生長(zhǎng)2 a后易轉(zhuǎn)化為生殖狀態(tài)，傾向于開花結(jié)果。因此，應(yīng)采用1.0～1.5 a生的白木香枝條作為芽條進(jìn)行嫁接。作為砧木的白木香種子苗可以是多年生的，但用于嫁接前，要作斷根移植處理，再?gòu)?fù)壯4個(gè)月，從而使其處于良好的非生殖生長(zhǎng)狀態(tài)。

優(yōu)化砧木和芽條生長(zhǎng)狀況，芽片的嫁接成活率可達(dá)90%以上，但嫁接成活芽片的發(fā)芽率卻有較大變化。嫁接后芽片上的芽在一定程度上處于休眠的狀態(tài)，砧木鋸頂后雖解除了頂端生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)對(duì)其萌發(fā)的抑制，但其萌發(fā)還受多種因素影響。因此，取芽片過(guò)程中需避免芽點(diǎn)被破壞。研究表明，充足的光照通過(guò)改變內(nèi)源激素GA、IAA和ABA的含量及比例［45-46］，啟動(dòng)芽的萌發(fā)［47-48］。同時(shí)，充分光照可提高溫度，加強(qiáng)芽萌發(fā)后的光合作用，促進(jìn)生長(zhǎng)。因此，砧木鋸頂后在充足的光照條件下生長(zhǎng)，有利于芽片的抽芽。

在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，砧木鋸頂后死亡是造成成活率降低的另一重要原因。影響砧木鋸頂后死亡的主要因子是鋸頂高度、環(huán)境溫度和水分。較低鋸頂?shù)母叨龋x嫁接口25cm），可有效解除頂端生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，加快芽片的抽芽，但容易使鋸頂砧木死亡；相反，鋸頂?shù)母叨仍礁撸@種致死的效果越小，但芽片發(fā)芽需要更長(zhǎng)的時(shí)間。為此，可采用“二次鋸頂”方法。第一次先在苗高的35%～40%位置鋸頂，并通過(guò)抹掉不定芽的方式誘導(dǎo)嫁接成活芽片抽芽，待其萌發(fā)芽生長(zhǎng)穩(wěn)定后再次鋸頂。

鋸頂后環(huán)境溫度過(guò)高（35℃以上），水分供應(yīng)不足，易使砧木快速失水死亡。海南夏季常出現(xiàn)極端性高溫，因此，需避開高溫季節(jié)，使用合適透光率的遮陽(yáng)網(wǎng)遮蔭，同時(shí)保證充足水分，有利于提高成活率。

總之，優(yōu)化各種培養(yǎng)條件可提高芽片的嫁接成活率和發(fā)芽率，有助于提高‘熱科2號(hào)’嫁接苗的繁殖效率。