李 安，周小青，孫 闊，楊謹(jǐn)如，朱勇飛，陸一鳴

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013)

藥物活性分子的靶點(diǎn)中80%以上為蛋白質(zhì)，包括膜表面的各類受體和離子通道、胞內(nèi)受體、酶、細(xì)胞因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子等。藥物通過與靶點(diǎn)結(jié)合，即相互作用，在體內(nèi)外發(fā)揮各種藥理功能。無論是在新藥篩選開發(fā)或是靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的過程中，檢測(cè)藥物分子與靶點(diǎn)的相互作用都是研究藥物作用機(jī)制、靶點(diǎn)確證及改造和優(yōu)化先導(dǎo)活性分子的關(guān)鍵一步。隨著分子生物學(xué)和生物物理學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，研究人員已經(jīng)能夠利用多種技術(shù)手段從藥物分子與靶蛋白相互作用的親和力、結(jié)合解離動(dòng)力學(xué)、熱動(dòng)力學(xué)以及藥物-靶點(diǎn)結(jié)合界面的結(jié)構(gòu)生物學(xué)信息等多個(gè)方面探索藥物的作用機(jī)制。本文對(duì)近年來最新發(fā)展的實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行總結(jié)，針對(duì)藥物研發(fā)進(jìn)程中的不同階段，介紹這些方法研究藥物與靶蛋白相互作用的原理、提供的信息以及優(yōu)勢(shì)與不足。

1 靶蛋白的尋找與確證

1.1 細(xì)胞熱轉(zhuǎn)變分析(CETSA)

當(dāng)藥物分子結(jié)合到靶蛋白上時(shí)，蛋白通常會(huì)變得更加穩(wěn)定。利用這一生物物理學(xué)原理，Karolinska研究所的研究人員開發(fā)出了一種檢測(cè)藥物與細(xì)胞內(nèi)和組織樣品內(nèi)的靶蛋白結(jié)合的方法，他們通過對(duì)加藥處理后提取的細(xì)胞或組織蛋白進(jìn)行梯度遞增加熱，結(jié)合Western-blot技術(shù)得到待測(cè)蛋白的熱穩(wěn)定性曲線，比較蛋白熱穩(wěn)定性的變化來評(píng)估藥物分子與靶蛋白的結(jié)合作用。因這種方法類似于體外的熱漂移實(shí)驗(yàn)(TSA)，他們便將其命名為CETSA(cellular thermal shift assay)[1]。利用這種方法成功鑒定了藥物分子與一系列重要的臨床靶標(biāo)之間的相互作用，并監(jiān)測(cè)了藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的脫靶與耐藥效應(yīng)。Shaw 等運(yùn)用CETSA技術(shù)報(bào)道了在前列腺癌細(xì)胞系內(nèi)鑒定與雄激素受體(AR)直接結(jié)合的藥物分子，同時(shí)他們以此方法對(duì)一個(gè)小分子化合物庫進(jìn)行了高通量篩選，驗(yàn)證并測(cè)算了AR與其拮抗劑分子在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下的親和力與Ki值[2]。CETSA很好地解決了無法直接觀察藥物分子與細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)結(jié)合的難題，在靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證領(lǐng)域?qū)⒛艿玫綇V泛應(yīng)用。

1.2 鄰近蛋白標(biāo)記

2012年，Roux等提出了一種在細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記蛋白相互作用的方法：鄰近蛋白標(biāo)記 (BioID)[3]。其基本原理是將誘餌蛋白和生物素連接酶在細(xì)胞中融合表達(dá)，在加入生物素后，與誘餌蛋白發(fā)生相互作用或距離很近的蛋白會(huì)被生物素連接酶標(biāo)記上生物素，再通過親和素純化被生物素標(biāo)記的蛋白，利用質(zhì)譜鑒定純化產(chǎn)物即可獲知與誘餌蛋白結(jié)合的蛋白。BioID非常適用于研究難溶或者難以提取的亞細(xì)胞、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)蛋白，能夠檢測(cè)到較弱的瞬時(shí)相互作用，并且鑒定到的是胞內(nèi)天然相互作用，接近體內(nèi)的真實(shí)生理環(huán)境。

然而BioID也有明顯的缺點(diǎn)，就是無法判斷待測(cè)蛋白與誘餌蛋白是直接相互作用還是間接的相互作用。為了解決這個(gè)問題，來自加利福尼亞大學(xué)的Zhuang等人，基于類泛素分子NEDD8 E2結(jié)合酶以及IAP(凋亡抑制因子)羧基端的泛素連接酶E3結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)了一種嵌合連接酶 NEDDylator，當(dāng)IAP的底物進(jìn)入E3活性位點(diǎn)時(shí)，NEDD8從E2轉(zhuǎn)移至E3接近底物蛋白并與其表面的賴氨酸發(fā)生共價(jià)結(jié)合(NEDD化)，利用這套標(biāo)記工具，他們發(fā)現(xiàn)了50多種IAP的候選底物，很好地捕捉到了經(jīng)典pull-down方法難以檢測(cè)到的胞內(nèi)蛋白間的瞬時(shí)相互作用。同時(shí)，由于NEDD8只能通過直接攻擊位于E3活性部位硫酯之上的底物蛋白賴氨酸實(shí)現(xiàn)對(duì)底物的標(biāo)記，確保了誘餌蛋白IAP與底物蛋白為直接接觸[4]。作為這項(xiàng)技術(shù)的衍生， Hill等[5]對(duì)NEDDylator進(jìn)行了改造，引入了SNAP標(biāo)簽，其一端與NEDD8 E2融合，另一端攜帶活性小分子，當(dāng)小分子與靶蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，生物素化的NEDD8可以共價(jià)連接到靶蛋白的分子表面，通過后續(xù)的富集鑒定可以準(zhǔn)確知曉小分子的靶蛋白。他們用這種方法在復(fù)雜的細(xì)胞裂解物中驗(yàn)證了藥物達(dá)沙替尼引導(dǎo)的NEDD化作用與已知內(nèi)源性蛋白的相互作用有關(guān)，這為鑒定小分子的靶標(biāo)提供了一種新的策略。

2 體外結(jié)合能力的測(cè)定

2.1 表面等離子共振技術(shù)

表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)是一種經(jīng)典的檢測(cè)生物分子相互作用的分析技術(shù)，近20年來廣泛應(yīng)用于藥物篩選、蛋白質(zhì)組學(xué)、抗體-抗原表位識(shí)別等領(lǐng)域，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)多肽、蛋白質(zhì)、DNA和寡聚糖等各類生物分子相互作用的整個(gè)過程，靈敏度高、特異性強(qiáng)，在獲得親和力KD值的同時(shí)能反映受體-配體的結(jié)合速率、解離速率、結(jié)合常數(shù)Ka和解離常數(shù)Kd等相互作用的動(dòng)力學(xué)信息[6]。然而由于SPR需將目的蛋白以氨基偶聯(lián)的方式包被在傳感器芯片上，蛋白的某些位點(diǎn)和區(qū)域的局部結(jié)構(gòu)可能會(huì)受到影響，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果不排除存在假陽性或假陰性的數(shù)據(jù)[7]。

作為SPR技術(shù)的延伸，表面等離子共振顯微鏡(SPR microscopy，SPRM)的應(yīng)用是近年來的一項(xiàng)重要進(jìn)展。傳統(tǒng)SPR需要提取細(xì)胞內(nèi)的蛋白或體外表達(dá)純化蛋白，用以偶聯(lián)到芯片表面，對(duì)于難溶和難以體外表達(dá)的膜蛋白無疑是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)和煩瑣的過程。而SPRM可以直接將活細(xì)胞固定在芯片陣列上并進(jìn)行培養(yǎng)，無需提取膜蛋白，可在原位實(shí)時(shí)地研究藥物配體分子與細(xì)胞的結(jié)合過程。同時(shí)，SPRM具有微米級(jí)高分辨率，單個(gè)細(xì)胞膜上蛋白的整體和局部的結(jié)合反應(yīng)都能被即時(shí)的監(jiān)測(cè)到，可以很好地反映藥物與天然狀態(tài)下膜蛋白的結(jié)合動(dòng)力學(xué)過程[8]。除了真核細(xì)胞外，SPRM還能在芯片上包被培養(yǎng)細(xì)菌或病毒顆粒，在原位研究抗生素、抗體、抑制劑等藥物分子與生物大顆粒的相互作用[9-10]。

2.2 等溫滴定量熱法

除了動(dòng)力學(xué)檢測(cè)和熒光檢測(cè)方法外，微量熱技術(shù)(microcalorimetry)也是研究較多的一種方法。受體和配體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)時(shí)，體系要么產(chǎn)生熱量，要么吸收熱量，等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry,ITC)就是在恒溫條件下將配體樣品逐滴滴入包含受體分子的樣品池中，直接測(cè)量反應(yīng)體系釋放或吸收的熱量變化來量化兩種分子間的相互作用。進(jìn)行一次滴定反應(yīng)除可得到親和力KD值外，還可以提供總能量變化ΔG、焓變 ΔH、熵變TΔS及化學(xué)計(jì)量比等熱力學(xué)參數(shù)，分析結(jié)合反應(yīng)的類型和作用機(jī)制，有助于理解哪種相互作用(氫鍵、范德華力、疏水作用或構(gòu)象變化)對(duì)總體結(jié)合親和力的貢獻(xiàn)較大。相對(duì)于SPR和MST，ITC既不需要固定化偶聯(lián)修飾蛋白，亦無需熒光標(biāo)記蛋白，反映了天然溶液狀態(tài)下的分子相互作用，較接近體內(nèi)生理環(huán)境狀態(tài)，與其他分子相互作用方法相比有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。ITC所確定的親和力參數(shù)常常被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”值，在生命科學(xué)和制藥領(lǐng)域已得到了廣泛認(rèn)可[11]。Justin 等開發(fā)了一對(duì)互補(bǔ)等溫滴定量熱法技術(shù)來測(cè)量酶抑制動(dòng)力學(xué)，他們用這種方法研究了脯氨酰寡肽(POP)與其共價(jià)和非共價(jià)抑制劑的相互作用，檢測(cè)到了跨越3個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)力學(xué)速率，包括過快的結(jié)合反應(yīng)以及低于標(biāo)準(zhǔn)ITC檢測(cè)閾值的的pM級(jí)別的親和力，大大拓展了經(jīng)典ITC的測(cè)定范圍[12]。

2.3 微量熱泳動(dòng)

微量熱泳動(dòng)(microscale thermophoresis,MST)是近幾年來新興的一項(xiàng)基于熒光檢測(cè)分子相互作用的研究技術(shù)。在微觀的溫度梯度場(chǎng)中，生物分子會(huì)發(fā)生定向運(yùn)動(dòng)，即熱泳動(dòng)現(xiàn)象，而生物分子在發(fā)生相互作用形成復(fù)合物之后，其分子量、分子構(gòu)象、水化層及帶電性質(zhì)會(huì)發(fā)生改變，引起定向運(yùn)動(dòng)尺度的改變，即在結(jié)合配體前后生物分子的熱泳動(dòng)程度存在變化。MST將熒光檢測(cè)與熱泳動(dòng)相結(jié)合，通過熒光標(biāo)記生物大分子，在溫度梯度毛細(xì)管中檢測(cè)分子的熒光分布變化，來分析標(biāo)記物與配體的親和力[13]。MST快速、靈敏、精確，樣品耗費(fèi)量少，且不需要將蛋白偶聯(lián)到固相表面，可直接測(cè)量溶液環(huán)境中分子間親和力，目前已有許多運(yùn)用在蛋白-蛋白、蛋白-小分子和蛋白-核酸相互作用的研究實(shí)例[14-16]。對(duì)于蛋白質(zhì)與多肽相互作用的檢測(cè)，也有研究人員采用MST成功測(cè)定了植物肽類激素PSK與受體蛋白PSKR的結(jié)合作用[17]。除了對(duì)特定的藥物分子-靶點(diǎn)相互作用進(jìn)行研究，NanoTemper公司還推出了一種全自動(dòng)機(jī)型Monolith NT.Automated，該機(jī)型將親和力檢測(cè)與自動(dòng)移液設(shè)備結(jié)合，30 min即可測(cè)定100個(gè)樣品，非常適合藥物先導(dǎo)分子的高通量篩選。Gerhard Klebe比較了不同方法從化合物庫中篩選先導(dǎo)片段分子，采用MST方法的命中率達(dá)到27%，高于TSA(8%)和傳統(tǒng)生化實(shí)驗(yàn)的命中率(17%)[18]。

3 結(jié)合位點(diǎn)與作用機(jī)制的鑒定

3.1 X射線晶體衍射

藥物分子與靶蛋白形成復(fù)合物共結(jié)晶是其與靶標(biāo)結(jié)合的最終驗(yàn)證，也是最直接、最可靠的證據(jù)。X射線晶體衍射(X-ray diffraction)是目前和未來較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)在原子水平確定生物大分子及復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的最為有效的手段，其分辨率能夠達(dá)到0.1 nm以下。隨著蛋白表達(dá)純化系統(tǒng)、晶體培養(yǎng)平臺(tái)、X射線衍射儀器和數(shù)據(jù)處理分析軟件的不斷升級(jí)換代，蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解析正在邁向高通量、自動(dòng)化。通過蛋白-小分子共結(jié)晶或小分子浸泡靶蛋白晶體的方法來獲得蛋白-小分子復(fù)合物的晶體，再利用X射線衍射收集數(shù)據(jù)并處理解析，就可以獲得靶蛋白與藥物分子結(jié)合的結(jié)構(gòu)信息[19]。

高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)往往有助于藥物開發(fā)者直接判定結(jié)合位點(diǎn)，并以此為基礎(chǔ)對(duì)藥物先導(dǎo)分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造來發(fā)展親和力更強(qiáng)或靶點(diǎn)選擇性更高的候選藥物，同時(shí)也可以明確藥物的作用機(jī)制與方式。然而，共結(jié)晶晶體的獲得是此技術(shù)最大的限制，許多活性分子可能由于結(jié)合動(dòng)力學(xué)、熱動(dòng)力學(xué)的性質(zhì)而不適于浸泡蛋白形成共結(jié)晶，因此也可能導(dǎo)致關(guān)于底物結(jié)合與否的假陰性判斷[20]。

3.2 核磁共振

相比于靜態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)，核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)可以測(cè)定生物大分子在溶液狀態(tài)下的一系列動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，可能更接近于生物分子在體液、細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)環(huán)境下的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。NMR在探測(cè)配體-蛋白相互作用和藥物篩選方面也有廣泛應(yīng)用?？煞譃閮煞N模式：基于配體(小分子)的相互作用觀察，可通過NMR波譜的化學(xué)位移直接驗(yàn)證小分子與受體蛋白的結(jié)合，得到親和力等參數(shù)，但不能獲悉結(jié)構(gòu)學(xué)方面的信息，不能看到結(jié)合位點(diǎn)[21-22]；基于蛋白的相互作用觀察，對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行15N或13C同位素單標(biāo)記，可以進(jìn)行二維滴定來明確配體結(jié)合到蛋白的哪個(gè)部位，而將蛋白同位素雙標(biāo)記則可以測(cè)定復(fù)合物的溶液三維結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)特征[23-24]。NMR應(yīng)用的技術(shù)瓶頸一是蛋白分子量的限制，分子量往往需要在40 000甚至30 000以下，而大部分具有重要功能的蛋白質(zhì)都超過了這個(gè)范圍。同時(shí)，蛋白在溶液中的狀態(tài)也必須非常均一穩(wěn)定，一般為單體。二聚體或多聚體的樣品由于譜峰信號(hào)重疊嚴(yán)重，往往不適合NMR實(shí)驗(yàn)。另一大難點(diǎn)是NMR需要大量同位素標(biāo)記的蛋白樣品，同位素標(biāo)記試劑的高成本和蛋白在更換培養(yǎng)基后的表達(dá)量問題亦會(huì)成為很大的阻礙。

3.3 X射線小角散射

X射線小角散射(small angle X-ray scattering，SAXS)可用于研究蛋白-蛋白、蛋白-DNA、蛋白-RNA和蛋白-小分子之間在溶液中的相互作用，提供有關(guān)靶蛋白的折疊、聚集狀態(tài)、內(nèi)在柔性以及復(fù)合物的形狀、尺寸、外殼結(jié)構(gòu)等信息[25]。雖然SAXS的分辨率僅能達(dá)到1～2 nm，但它可以用來監(jiān)測(cè)配體對(duì)蛋白-蛋白相互作用的調(diào)節(jié)效應(yīng)和對(duì)靶蛋白構(gòu)象、寡聚狀態(tài)的影響，對(duì)揭示藥物分子的藥理機(jī)制有很大幫助。SAXS能夠通過檢測(cè)溶液微環(huán)境的變化而檢測(cè)到較弱的相互作用，同時(shí)提供配體-蛋白結(jié)合解離過程的平衡態(tài)、化學(xué)計(jì)量學(xué)等信息，對(duì)于超大分子量的或超聚體復(fù)合物，可以聯(lián)合單個(gè)分子的X線晶體結(jié)構(gòu)或NMR結(jié)構(gòu)來構(gòu)建蛋白-配體復(fù)合物的低分辨率結(jié)構(gòu)模型，從而直觀地反映高分子復(fù)合物的組裝動(dòng)力學(xué)過程[26]。

4 總結(jié)與展望

隨著分子生物學(xué)和生物物理學(xué)的不斷突破與進(jìn)展，基于各種原理的分子相互作用研究手段在進(jìn)行飛快的更新與升級(jí)換代。研究者在藥物研發(fā)和靶點(diǎn)機(jī)制的探索過程中已不僅限于采用單一的方法來分析藥物-靶點(diǎn)的相互作用，聯(lián)合運(yùn)用多種相互作用檢測(cè)技術(shù)往往能大幅提高新藥篩選的通量和效率。同時(shí)，多種方法之間可以互相取長(zhǎng)補(bǔ)短以增強(qiáng)研究結(jié)果的可靠性，能夠最大限度地避免假陽性或假陰性的誤判[27-29]。另外，藥物分子與靶點(diǎn)的結(jié)合也逐漸由單純的體外親和力測(cè)定發(fā)展為溶液、胞內(nèi)和體內(nèi)生理狀態(tài)下的鑒定模式，諸如CETSA和BioID這類技術(shù)能幫助我們更直接地探查藥物在體內(nèi)的真實(shí)效能與作用方式，雖然在方法上還存在諸多不足需要改善，但相信不久的將來會(huì)成為研究藥物相互作用的有力手段。