楊金宏，孔衛(wèi)青

(安康學(xué)院 陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 安康 725000)

家蠶(Bombyxmori)是一種重要的吐絲結(jié)繭的經(jīng)濟(jì)昆蟲，桑葉是家蠶唯一的食物，家蠶對桑葉的消化吸收效率，暨葉絲轉(zhuǎn)化率(繭層量/食下量)是蠶桑生產(chǎn)效益的重要指標(biāo)之一。腸道菌群定殖在宿主腸道內(nèi)，與宿主相互依賴、互利共生，對宿主的消化吸收和生長發(fā)育有重要影響。家蠶腸道菌群豐富，高繪菊等對家蠶中腸菌群進(jìn)行分離培養(yǎng)，顯示其中存在多種可以分泌蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、淀粉酶的菌種[1]。鄒昌瑞等分離培養(yǎng)柞蠶中腸菌，顯示芽孢桿菌是其主要菌群，可以產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶[2]。但上述研究均未發(fā)現(xiàn)其中分泌果膠酶的菌株。

蠶沙是家蠶排泄物，含大量未被家蠶消化吸收的桑葉成分，其中果膠占風(fēng)干蠶沙的10%～12%，是家蠶不能吸收利用的桑葉成分之一。外源添食纖維素單胞菌、枯草芽孢桿菌或外源性芽孢桿菌等，給家蠶添食均對家蠶的生長發(fā)育、腸道優(yōu)勢菌群和經(jīng)濟(jì)性狀有一定影響[3-6]。因此，研究家蠶產(chǎn)果膠酶菌株，通過外源添加菌群，促進(jìn)家蠶對桑葉果膠的消化吸收，對提高家蠶葉絲轉(zhuǎn)化率具有重要意義。

中腸是家蠶分泌消化酶、消化吸收桑葉的主要場所，中腸腸液pH值在9.2以上，中腸中部的pH值甚至達(dá)10.5～11.0，強(qiáng)堿性環(huán)境抑制了果膠酶產(chǎn)生菌的發(fā)生。而中腸后部至排出蠶沙中的菌群研究鮮見報(bào)道。本研究擬分離家蠶蠶沙的果膠酶產(chǎn)生菌，為通過外源添加降解桑葉中果膠、提高家蠶對桑葉果膠成分的消化吸收和家蠶葉絲轉(zhuǎn)化率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)使用的5齡3 d家蠶871×872飼養(yǎng)于安康學(xué)院恒口蠶?？蒲谢兀忧? h置于超凈工作臺(tái)，用無菌樣品盒飼養(yǎng)，取排出30 min內(nèi)的新鮮蠶沙。

1.2 菌株的分離篩選與鑒定

取1.1新鮮蠶沙3 g，加入到50 mL 富集培養(yǎng)液中，無菌玻璃棒攪拌，30℃ 160 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d后，按10-6～10-9梯度對培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，并均勻涂布到分離培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)2 d。后從平板上挑取較大的菌落，進(jìn)行再次分離純化，獲得單菌落。在菌落周圍加入幾滴1%的CTAB，靜置10 min, 若有透明圈產(chǎn)生則為堿性果膠酶產(chǎn)生菌。

1.3 菌株16S rDNA序列獲取及分析

提取菌株的基因組DNA，16S rDNA通用引物對27F和1492R擴(kuò)增菌株的16S rDNA，PCR擴(kuò)增條件參照Oliwa-Stasiak等[7]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工(生物工程)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果進(jìn)行在線BLASTN比對，同時(shí)下載克雷伯氏菌屬內(nèi)物種的同源系列，MEGA 6.0軟件的極大似然法(Maximum Likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)1 000次進(jìn)行Bootstrap檢驗(yàn)，確定菌株歸屬[8]。

1.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化與生長曲線的測定

分別以淀粉、果膠、蔗糖、葡萄糖為碳源，配制濃度0.1 g·L-1，以硫酸銨、酵母粉、蛋白胨、蠶蛹粉為培養(yǎng)氮源，配制濃度0.05 g·L-1，正交設(shè)計(jì)配制菌株培養(yǎng)基100 mL，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值為8.0。1：100加入培養(yǎng)液，35℃培養(yǎng)2 d，3個(gè)重復(fù)篩選菌株生長最佳碳氮源。分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，設(shè)定培養(yǎng)溫度為25 ℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50 ℃，研究培養(yǎng)基pH值和培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響。采用測定培養(yǎng)液OD600或細(xì)菌計(jì)數(shù)法(THAOMA)分析培養(yǎng)結(jié)果。最后利用最優(yōu)培養(yǎng)條件測定每隔5 h菌液的OD600，重復(fù)3次求平均值，繪制菌株生長曲線。

1.5 菌株產(chǎn)酶活性的測定

取培養(yǎng)2 d的菌液，無菌四層紗布過濾，濾液5 000 r·min-1離心15 min，上清液即為粗酶液。取粗酶液20 μL，與含0.2%聚半乳糖醛酸的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH8.6)2 mL混合，后分別添加5 mmol·L-1鈣、鎂、錳、鋅等二價(jià)離子至不同測試管，以未添加金屬離子測試管為對照，檢測不同金屬離子對酶活性的影響。30℃反應(yīng)10 min，加入0.03 mol·L-1磷酸溶液3 mL終止反應(yīng)，測定235 nm 處吸光度，記為A，以同樣體系加熱煮沸10 min的粗酶液做空白對照，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活單位(U)定義為：1 mL酶液每min使聚半乳糖醛酸裂解產(chǎn)生1 μmol的不飽和聚半乳糖醛酸的酶量。不飽和聚半乳糖醛酸在235 nm 處的摩爾吸光系數(shù)a為4 600 L·mol-1cm-1。根據(jù)公式：A=abc，其中b=1 cm，計(jì)算樣品濃度平均值c，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)特征與CTAB顯色法鑒定

菌株在分離培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)2 d的菌落為圓形(圖1A)，直徑1.5～2 mm，扁平，邊緣整齊，灰白色，稍微不透明，有淡淡的異味。利用CTAB顯色法對菌株進(jìn)行鑒定，產(chǎn)生明顯的透明圈(圖1B)，初步確定該菌為堿性果膠酶產(chǎn)生菌。

圖1 菌株菌落形態(tài)(A)與水解圈鑒定(B)

2.2 基于16S rDNA的菌株鑒定

對菌株的16S rDNA序列進(jìn)行的PCR擴(kuò)增和測序，獲得1408 bp的DNA序列(GenBank登錄號(hào)：MH916560)。在線BLASTN比對，其與Klebsiellasp. SPC06的16S rDNA的一致性達(dá)99%。MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，本菌與產(chǎn)酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、格氏勒米諾克雷伯氏菌(K.grimontii)等優(yōu)先聚合在一起。結(jié)合菌株形態(tài)特性，確定該菌為克雷伯氏菌屬Klebsiellasp.，命名Klebsiellasp. AKB01。

圖2 基于16srDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，加粗分支為Klebsiellasp.AKB01；括號(hào)中字符為基因登錄號(hào)

2.3 菌株AKB01培養(yǎng)條件的優(yōu)化

不同碳氮源對菌株AKB01生長影響的研究顯示(圖3)，葡萄糖和酵母粉組合條件下菌株生長最快，菌液活菌量8.58*108個(gè)·mL-1，其次是蔗糖和酵母粉組合(7.84*108個(gè)·mL-1)，淀粉和硫酸銨組合條件下生長最慢(1.40*108個(gè)·mL-1)。因此葡萄糖和酵母粉是菌株生長的最適碳氮源。

進(jìn)一步研究培養(yǎng)溫度和初始pH值對菌株AKB01生長的影響，結(jié)果表明(圖4)，菌株的最佳生長溫度為 35℃，低于25℃或高于40 ℃生長速度明顯下降。菌株生長的最適pH為8.0，pH小于5.0或大于9.5時(shí)生長幾乎停滯?；诖?，得到本研究菌株AKB01的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：1%葡萄糖，0.5%酵母粉，pH 8.0，溫度35 ℃。最優(yōu)培養(yǎng)條件下，繪制菌種的生長曲線，發(fā)現(xiàn)15 h菌株進(jìn)入對數(shù)生長期，35 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(圖5)。

圖3 不同碳氮源組合對菌株生長的影響

圖4 不同溫度和起始pH對菌株AKB01生長的影響

2.4 不同金屬離子對菌株堿性果膠酶活性的影響

以5 mmol·L-1二價(jià)金屬離子作為輔助劑，測定粗酶液的酶活性，結(jié)果對照中，菌株的酶活性僅0.98 U·mL-1，添加不同金屬離子酶活性存在差異(圖6)，添加鈣離子酶活性最高為48.50 U·mL-1，鎂離子時(shí)最低為5.39 U·mL-1，符合果膠酸裂解酶的特點(diǎn)[9]。

圖5 菌株AKB01生長曲線

圖6 不同二價(jià)金屬離子對酶活性的影響

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以果膠為唯一碳源從蠶沙中的分離獲得果膠酶產(chǎn)生菌，并利用酶水解透明圈和16S rDNA序列對篩選獲得菌株進(jìn)行鑒定，命名為Klebsiellasp. AKB01，這也是首次從蠶沙中分離得到分泌果膠酶的菌株，說明在堿性較弱的家蠶中腸后部(pH值8.0-9.0左右)，可能存在產(chǎn)果膠酶菌株，為進(jìn)一步家蠶對果膠的消化吸收以及家蠶腸道產(chǎn)果膠酶微生物菌群的研究提供了參考。

外源添加家蠶腸道的優(yōu)勢菌群，也可加強(qiáng)腸道優(yōu)勢菌群能力，對家蠶全繭量和繭層量等繭絲經(jīng)濟(jì)性狀具有顯著改善。本研究分離菌株AKB01在pH值大于9.5時(shí)生長緩慢或停滯，而中腸中部為強(qiáng)堿性環(huán)境，對菌株的生長具有抑制甚至滅活作用，因此目前很少有家蠶腸道產(chǎn)果膠酶相關(guān)菌的報(bào)道。

二價(jià)金屬離子是果膠酶發(fā)生作用的輔助因子，鈣離子可顯著提高菌株AKB01的堿性果膠酶的活性至48.50 U·mL-1，酶活性稍低于來源于史密斯桿菌產(chǎn)堿性果膠酶的菌株(88U·mL-1)[10]，與枯草芽孢桿菌的酶活性相當(dāng)45 U·mL-1[11]，高于芽孢桿菌 WSHB04-02(34 U·mL-1)[12]，符合野生菌株的特征。該菌株發(fā)酵周期短，為堿性果膠酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)。